BMP9诱导永生化小鼠颅骨骨缝干细胞分化的初步研究
目前在临床中,由于创伤、肿瘤、退变及先天性等因素导致的骨缺损还很常见,虽然在骨重建中骨科内固定和手术技术方面取得了很大的进步,但通过手术进行骨重建中还是会遇到很多的挑战,比如自体骨量和供区的限制等。随着再生医学和骨组织工程的发展,给骨重建提供了一种新的选择。<br>  种子细胞、生物支架材料、生物活性因子是骨组织工程的三要素,其中种子细胞是骨组织工程的最基本的环节。种子细胞为再生医学和组织工程提供活性成分的主要来源,是其核心部分。干细胞作为具有多向分化潜能的特点,是目前应用最广泛的种子细胞。<br>  颅骨骨缝组织具有很强的...
目前在临床中,由于创伤、肿瘤、退变及先天性等因素导致的骨缺损还很常见,虽然在骨重建中骨科内固定和手术技术方面取得了很大的进步,但通过手术进行骨重建中还是会遇到很多的挑战,比如自体骨量和供区的限制等。随着再生医学和骨组织工程的发展,给骨重建提供了一种新的选择。
  种子细胞、生物支架材料、生物活性因子是骨组织工程的三要素,其中种子细胞是骨组织工程的最基本的环节。种子细胞为再生医学和组织工程提供活性成分的主要来源,是其核心部分。干细胞作为具有多向分化潜能的特点,是目前应用最广泛的种子细胞。
  颅骨骨缝组织具有很强的增殖能力,其在人生中的前三十年中颅骨的形成过程中起着至关重要的作用。与一般长骨软骨下成骨方式不同的是颅骨骨缝组织的成骨主要是通过膜内成骨。其成骨原理是在一定的刺激条件下其骨化位点通过重叠的成骨前缘间充质干细胞的聚集、分化而进一步成骨。研究表明颅骨骨缝干细胞具有一定的分化潜能。通过颅骨骨缝组织干细胞的研究,对进一步研究膜内成骨的机制和特点、探索为再生医学和组织工程良好的种子细胞具有重要意义,同时也为进一步研究颅骨骨缝早闭等疾病有重要意义。
  通常情况下正常的组织细胞,在体外培养一段时间后,细胞会出现生长停滞,即M1期(衰老期),细胞继续增殖后会进入增殖抑制状态,即M2期(危机期),随后细胞逐渐出现退化、死亡。这些情况同样会发生在于细胞身上。这为再生医学和组织工程细胞来源及研究带来诸多限制,尤其是那些稀少、取材困难的细胞。通过细胞永生化可以使细胞获得持续增殖的能力。为再生医学和组织工程提供了足够的种子细胞,更有利于进行实验研究。
  BMPs属于TGF-β超家族,家族至少有20个成员,BMPs在大多数物种均有表达。BMPs在体内具有广泛的作用,除了广为所知的诱导成骨分化的能力外,还参与多种组织和器官的形成和修复。多种BMPs被报道具有诱导成骨的能力,诱导成骨BMP2、BMP4、BMP6、BMP、BMP9的报道较多。课题组前期实验证明,BMP9在众多BMPs中对骨间充质干细胞具有最强的成骨诱导能力,同时还有诱导成软骨和成脂肪的能力。课题组前期研究亦证实,BMP9对多种不同部位来源的干细胞具有较好的多向诱导分化能力。因此,在颅骨骨缝干细胞研究中,我们仍选择BMP9作为细胞因子进行诱导永生化小鼠颅骨骨缝干细胞。
  作为再生医学和组织工程很重要的组成部分,材料科学的发展极大的推进了再生医学和骨组织工程的发展,越来越多科学实验和临床应用得到了验证和推广。目前对于骨组织材料的基本特性是能给细胞迁移、增殖和分化提供三维结构环境,在一些承重的组织中,它同样可以起到暂时的机械结构支撑作用。一个理想的支架材料需要满足以下特点:①骨组织材料的三维和多孔网状结构有利于细胞生长、营养和代谢产物的运输。②表面特性有利于细胞贴附、迁移、增殖和分化。③具有生物相容性,不会引起免疫反应,在细胞/组织生长过程中其生物降解率可控。1④其力学特性应当跟移植区域的组织相当⑤应当具有可塑性。PCCN作为一种新型的支架材料,除了具备以上特点外,还具有温敏可控塑形的特点。为了验证这种新型支架材料对骨及软骨修复中的作用,我们用PCCN复合BMP9诱导下的小鼠颅骨骨缝干细胞体内注射的方法来验证新型支架在组织工程中的作用。
  目的:
  1、运用piggyBac转座系统构建永生化的小鼠颅骨骨缝干细胞,并进行干细胞标志物鉴定。
  2、比较SCCSs与iSCCSs细胞系的增殖率差异。
  3、iSCCSs的逆转永生化及体内成瘤风险研究。
  4、BMP9诱导永生化小鼠颅骨骨缝干细胞的体外分化潜能研究。
  5、BMP9诱导永生化小鼠颅骨骨缝干细胞并复合PCCN体内分化初步研究。
  方法:
  1、选取1周大小的无菌CD1小鼠,麻醉起效后将小鼠断颈处死,无菌操作暴露颅骨骨缝,取颅骨骨缝组织,采用Ⅰ型胶原酶溶解方法使细胞贴壁获得原代细胞。用piggyBac转座系统将永生化基因SV40T抗原转染至原代细胞中,构建永生化小鼠颅骨骨缝干细胞。
  2、采用细胞免疫荧光染色的方法鉴定iSCCSs的间充质干细胞标志物。
  3、通过体外培养观察、结晶紫染色、WST-1等方法,比较永生化小鼠颅骨骨缝干细胞与原代细胞增殖能力的差异。
  4、体外通过利用Flip/FRT重组系统,将永生化基因SV40T抗原敲除,通过体外培养观察、结晶紫染色、WST-1及Touch-down qPCR等方法来鉴定iSCCSs的逆永生化;通过对裸鼠体内注射iSCCSs后活体成像检测来鉴定其有无体内成瘤风险性。
  5、利用腺病毒感染技术,用Ad-BMP2、Ad-BMP4、Ad-BMP6 Ad-BMP7、Ad-BMP9分别对iSCCSs进行感染,通过ALP染色、ALP活性读数、茜素红染色和Touch-down qPCR的方法比较多种BMP对iSCCSs的体外诱导成骨能力。
  6、利用腺病毒感染技术,用Ad-BMP9分别感染实验室前期已经验证过具有较强成骨能力的干细胞iCALs、iSCAPs、iMEFs及本实验构建的iSCCSs,通过ALP染色及ALP活性读数来大致比较各种细胞系BMP9诱导下的体外成骨能力。
  7、通过ALP染色和ALP活性读数检测BMP9诱导iSCCSs成骨分化时间相关性和剂量相关性;运用免疫荧光染色的方法来鉴定BMP9诱导下的OCN的表达;运用油红染色鉴定BMP9诱导下iSCCSs的成脂能力;运用Alician Blue染色的方法检测BMP9诱导下iSCCSs的成软骨能力。应用Touch-down qPCR来鉴定相关成骨、成脂、成软骨基因的表达。
  8、将Ad-BMP9诱导下iSCCSs采用单纯细胞和复合新型支架材料PCCN于裸鼠皮下注射和肌肉注射。通过Micro-CT扫描来检测BMP9的体内诱导成骨能力和支架材料PCCN在成骨中的作用。通过对成骨包块石蜡切片的HE染色、Alician Blue染色、Trichrome染色来检测BMP9体外诱导iSCCSs的成骨、成脂、成软骨能力和PCCN的作用。
  结果:
  1、成功获得原代小鼠颅骨骨缝干细胞,并通过piggyBac转座系统成功构建永生化小鼠颅骨骨缝干细胞。
  2、对iSCCSs进行干细胞表面标记物免疫荧光染色,结果显示CD29(interginβ1)、CD73、CD113(prom1)、CD40、CD90(Thy1)、CD117(c-kit)、CD166(ALCAM)、CD105(Endglin)和BMPRII具有表达。证实了iSCCSs保持了间充质干细胞的干细胞特性。
  3、通过体外培养观察、结晶紫染色、WST-1等方法证实与原代细胞相比,永生化后的小鼠扁骨骨缝干细胞具有更强的增殖能力,这种增殖上的差异自培养后第一天即存在,并且在第三、五、七各个时间段均存在明显差异。
  4、体外通过利用Flip/FRT重组系统,将永生化基因SV40T抗原敲除,通过体外培养观察、结晶紫染色、WST-1证实:对照组(Ad-GFP组)细胞增殖能力仍然旺盛,而实验组Ad-Flip组细胞的增殖速度明显变慢,在连续七天内,增殖率一致维持在一个较低的水平。Touch-down qPCR结果SV40T抗原基因在实验组的表达明显低于对照组。证实SV40T抗原基因能够被敲除,细胞的永生化可以逆转。
  5、应用piggyBac转座系统成功构建萤光虫荧光素酶(Fluc)标记的iSCCS细胞(iSCCSs-Fluc)。裸鼠体内注射iSCCSs后活体成像检测显示在iSCCSs-Fluc注射后,5天的时候信号强烈,10天的时候信号较前出现衰减,到第15天的时候信号已经基本消失。通过大致观察皮下注射部位亦无肿瘤样物生成。表明iSCCSs在体内具有较强的增殖能力,但是无成瘤的危险。
  结论:
  1、利用piggyBac转座系统成功构建永生化小鼠颅骨骨缝干细胞,永生化的小鼠颅骨骨缝干细胞能够长时间进行多代培养,并且永生化的小鼠颅骨骨缝干细胞保持了间充质干细胞干性。
  2、永生化的小鼠颅骨骨缝干细胞增殖率明显高于原代细胞,并且其增殖活性可以因永生化基因SV40T抗原被Flip/FRT重组酶敲除而逆转;体内注射正式永生化小鼠颅骨骨缝干细胞无成肿瘤倾向。
  3、BMP9对永生化小鼠颅骨骨缝细胞的诱导成骨能力在已知具有诱导成骨能力的BMP中是最强的,并且诱导成骨能力与BMP9具有剂量和时间相关性。
  4、体外实验证实,与常见具有成骨分化潜能的细胞相比永生化小鼠颅骨骨缝干细胞具有较强的成骨能力。
  5、体内、体外实验都证实小鼠颅骨骨缝干细胞具有向成骨、成软骨、成脂肪分化的能力。
  6、新型支架材料PCCN能够给细胞黏附、增殖、分化提供较好的三维分层结构,促进BMP9诱导iSCCSs的成骨和成软骨作用。
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作者: 卢舜
学科专业: 外科学(骨外)
授予学位: 博士
学位授予单位: 山东大学
导师姓名: 周东生
学位年度: 2016
语 种: chi
分类号: R329.2
在线出版日期: 2016年10月21日