副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究
副猪嗜血杆菌(HPS)引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,随着世界养猪业的发展,该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。我国是一个养猪大国,但目前仍没有对副猪嗜血杆菌进行系统研究的报道。本研究对副猪嗜血杆菌的病原学、流行病学、诊断方法和灭活疫苗进行研究,为我国副猪嗜血杆菌病的基础研究以及我国对于该病的诊断、预防与控制奠定基础,主要研究内容如下: 1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及关于我国的病原学调查 从全国十五个省市送本室检测的疑似患多发浆膜炎、关节炎和脑膜炎的病料中分离到281株细菌,通过细菌形态、培养特...
副猪嗜血杆菌(HPS)引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎,随着世界养猪业的发展,该病已成为全球范围内影响养猪业的一种重要细菌性疾病。我国是一个养猪大国,但目前仍没有对副猪嗜血杆菌进行系统研究的报道。本研究对副猪嗜血杆菌的病原学、流行病学、诊断方法和灭活疫苗进行研究,为我国副猪嗜血杆菌病的基础研究以及我国对于该病的诊断、预防与控制奠定基础,主要研究内容如下: 1.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及关于我国的病原学调查 从全国十五个省市送本室检测的疑似患多发浆膜炎、关节炎和脑膜炎的病料中分离到281株细菌,通过细菌形态、培养特性、生化特性及PCR鉴定最终确定为副猪嗜血杆菌。对从2003年6月到2004年12月送我室检测的828例病料进行细菌分离鉴定,结果有183例分离出副猪嗜血杆菌,分离率高达22.1%,表明该菌在我国广泛流行。对本室分离的所有副猪嗜血杆菌按琼脂扩散试验和间接血凝试验血清学分型方法进行血清型鉴定,结果表明我国以血清4型(24.2%)和5型(19.2%)最为流行,其次为13型(12.5%)、14型(7.1%)和12型(6.8%),另外有12.1%的分离菌株不能进行血清学分型。该结果为我国对于副猪嗜血杆菌病的预防与控制提供了参考依据。 2.副猪嗜血杆菌生物学特性的研究 以本室分离鉴定的副猪嗜血杆菌MD0322株和SH0165株为代表菌株对该菌的各种生物学特性进行研究。对不同固体培养基的比较发现该菌在TSA固体培养基和TM/SN固体培养基上生长最好,对不同液体培养基的比较发现该菌在TSB液体培养基、TMB液体培养基和BHI液体培养基中生长最好。副猪嗜血杆菌在’TSB液体培养基中的生长曲线显示培养16~18h活菌数达到最高峰,随后大幅下降。副猪嗜血杆菌在生理盐水、磷酸盐缓冲液和TSB液体培基中4℃保存的存活曲线显示该菌在以上介质中每保存一天时间其活菌数均要下降一个对数值左右,说明副猪嗜血杆菌通常不能采用单纯的平板菌落计数法活菌计数。本研究提出的分光光度计测定法合理地解决了副猪嗜血杆菌即时计数的问题,为该菌各种动物实验的开展奠定了基础。 3.副猪嗜血杆菌抗体间接血凝试验检测方法的建立及我国血清学调查 将副猪嗜血杆菌经超声波破碎处理后的产物致敏醛化鞣酸化红细胞,建立间接血凝试验用于检测副猪嗜血杆菌抗体。采用该法对副猪嗜血杆菌15种血清型标准血清的检测结果都为阳性;对猪瘟、口蹄疫、圆环病毒、细小病毒、猪伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、猪气喘病、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪传染性萎缩性鼻炎及胸膜肺炎等病原的标准阳性血清的检测结果全为阴性,具有良好的特异性。本检测方法最低可检测出1:2<'11>倍稀释的高免血清,具有良好的敏感性。按本方法制备的间接血凝诊断试剂保存期可达6个月。本研究为副猪嗜血杆菌抗体的检测提供了一种简捷、灵敏和特异的方法。采用该间接血凝试验检测方法从2005年3月到2005年12月对全国七个省份共血清1665份的抽检结果阳性784份,阴性881份,阳性率47.1%,从抗体方面表明副猪嗜血杆菌病在我国各地流行较普遍。 4.副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的研究 4.1副猪嗜血杆菌病灭活疫苗制备与检验用菌株的筛选 根据本室完成的副猪嗜血杆菌流行病学调查结果,以我国最流行的血清4型和5型菌株研制疫苗,通过对临床资料及动物试验结果的比较筛选出毒力较强,免疫原性较好的菌株即血清4型MD0322株和血清5型SH0165株作为疫苗候选菌株,毒力稳定性和免疫原性稳定性试验结果表明两株菌种连传25代后仍保持稳定,因而最终确定这两株细菌作为副猪嗜血杆菌病灭活疫苗制备与检验用菌株。 4.2副猪嗜血杆菌病灭活疫苗基础菌种的研究 按照《中国兽用生物制品质量标准》要求建立用于副猪嗜血杆菌病灭活疫苗制备与检验用菌株的基础种子,对基础菌种的形态、培养特性、生化特征、血清型、毒力、免疫原性、毒力稳定性和免疫原性稳定性等进行研究。结果表明基础菌种在方面均符合副猪嗜血杆菌的特征,MD0322株为血清4型,SH0165株为血清5型,基础菌种纯粹检验无杂菌生长,两株菌种连代25代以后的毒力和免疫原性均保持稳定不变,在各方面完全符合基础菌种的要求。 4.3副猪嗜血杆菌病灭活疫苗安全性试验 在实验室试制五批副猪嗜血杆菌病灭活疫苗,批号依次为0301、0302、0303、0304、0305。通过对最小使用日龄靶动物接种、对靶动物各种接种途径一次单剂量接种,对靶动物单剂量重复接种,对靶动物一次超剂量接种以及对怀孕动物(妊娠母猪)接种后观察其精神状态,体温和食欲等指标对疫苗的安全性进行了评价,结果表明该疫苗用于猪的免疫是安全的,无副作用。 4.4四种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗对仔猪免疫效力的比较 用副猪嗜血杆菌MD0322株和SH0165株两株菌种分别制备副猪嗜血杆菌病单价灭活疫苗。将两种单价灭活疫苗与本室试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(双价),以及国外生产的两种副猪嗜血杆菌病灭活疫苗相比较,每种灭活疫苗分别免疫28~35日龄仔猪10头,21日后二免,同时设立10头未免疫对照。二免后14日,分别用血清4型和5型标准菌株经腹腔内攻毒,结果两种单价疫苗的保护率均为4/5,本室试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗总的保护率为9/10,两种进口疫苗的总保护率分别为8/10(疫苗含血清4型和5型菌)和5/10(疫苗含血清2型和6型菌)。 4.5副猪嗜血杆菌病灭活疫苗效力试验 通过动物试验对试制的五批副猪嗜血杆菌病灭活疫苗进行效力检验。每批选择28~35日龄断奶仔猪20头,每批疫苗免疫10头猪,另外10头作为对照。在二免后14日分别用MD0322株和SH0165株通过腹腔内攻毒,结果免疫猪保护率均在4/5以上,对照组发病率均在3/5以上,表明试制的副猪嗜血杆菌病灭活疫苗具有良好的免疫效果。 4.6副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的免疫期及抗体消长规律测定 用本室试制的五批灭活疫苗对其免疫期和免疫猪的抗体消长规律进行研究。五批疫苗按常规免疫剂量分别对母猪和14日龄仔猪免疫,于免疫后7、14、28、60、90、120、150、180、2lO日采血测定抗体。结果在疫苗免疫后2周开始检测出抗体,以后抗体效价逐渐上升,60~120日处于高峰,以后逐渐下降,持续至免疫后180日。母猪免疫后的抗体消长规律与仔猪的抗体消长规律基本一致,但抗体效价高于仔猪。表明副猪嗜血杆菌病灭活疫苗加强免疫后的免疫期可达6个月。 4.7副猪嗜血杆菌母源抗体与仔猪免疫的相关性 将试验仔猪分成4组,每组10头。第1组仔猪为未免疫母猪所产,并且仔猪未免疫;第2组仔猪为未免疫母猪所产,但仔猪实行免疫;第3组仔猪为免疫母猪所产,但仔猪未免疫;第4组仔猪为免疫母猪所产的仔猪,并且仔猪实行免疫。分别在仔猪出生后第2、7、14、21、28、35、42和48日采血用间接血凝试验和琼脂扩散试验测定血清抗体效价。通过对抗体检测结果的比较发现母源抗体水平在免疫母猪所产仔猪显著高于非免疫组母猪所产仔猪。另一方面,免疫母猪和非免疫母猪所产仔猪在免疫后所激发的抗体水平没有显著差异,表明母源抗体对仔猪的免疫不存在影响。 4.8副猪嗜血杆菌病灭活疫苗的保存期试验 本室试制的五批疫苗副猪嗜血杆菌病灭活疫苗在2~8℃保存15个月没有出现破乳、分层、沉淀现象。在疫苗的不同保存期分别以2ml剂量对14日龄哺乳仔猪免疫,21日后二免,每批疫苗免疫10头猪,在首免后21日采血检测其间接血凝抗体,结果效价均在1:16以上。在二免后14日用血清4型和5型副猪嗜血杆菌按一定剂量进行攻毒,结果对照组发病率均在3/5以上,而免疫组保护率均在4/5以上,达到疫苗效力检验的要求,表明本疫苗可在2~8℃保存15个月质量保持不变。
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作者: 蔡旭旺
学科专业: 预防兽医学
授予学位: 博士
学位授予单位: 华中农业大学
导师姓名: 陈焕春
学位年度: 2006
语 种: chi
分类号: S858.28 S852.612
在线出版日期: 2007年7月2日