定向诱导分化的骨髓间充质干细胞对糖尿病胰岛的修复作用
第一部分:胰腺干细胞诱导骨髓间充质干细胞定向分化的研究<br>  目的:干细胞是机体及其各种组织细胞的初始来源,其最为显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力,又有多向分化的潜能。干细胞根据不同来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem,ES)、诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem,iPS)及成体干细胞。<br>  骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)是骨髓中除了造血干细胞之外的另一大类干细胞,体外培养形态呈成纤维细胞样,近年来发现还可以分化成许多种类的组织细胞,如中胚层的软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞...
第一部分:胰腺干细胞诱导骨髓间充质干细胞定向分化的研究
  目的:干细胞是机体及其各种组织细胞的初始来源,其最为显著的生物学特征是既有自我更新和不断增殖的能力,又有多向分化的潜能。干细胞根据不同来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem,ES)、诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem,iPS)及成体干细胞。
  骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)是骨髓中除了造血干细胞之外的另一大类干细胞,体外培养形态呈成纤维细胞样,近年来发现还可以分化成许多种类的组织细胞,如中胚层的软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、内皮细胞细胞;外胚层的神经元细胞;内胚层的肝卵圆细胞等。越来越多的实验证据显示 BMSC还有免疫调节、抗炎、促进血管新生、营养等作用,与胚胎干细胞或其他组织特异的干细胞相比,间充质干细胞有许多优势,如容易获得、少伦理限制和低免疫原性。这使得BMSC成为一种在组织工程、再生医学和自身免疫疾病治疗方面理想的种子细胞。然而直接移植BMSC往往由于靶向性不足而使得治疗效果不佳。
  胰腺干细胞(pancreatic stem cells,PSCS)是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞,是保持着未达终末分化状态的具有自我更新和多分化潜能的细胞。由于胰腺干细胞来源十分匮乏,并且存在免疫排斥等问题,且直接移植或者诱导其形成类胰岛样细胞团后移植,治疗效果也不理想。
  本实验采用PSCS与BMSC共培养方法,以期定向诱导BMSC向胰腺细胞的方向分化,为其在糖尿病中的应用提供基础。
  用光镜观察原代分离培养的BMSC和 PSCS细胞形态,用流式细胞术和免疫荧光法鉴定BMSC和PSCS,RT-PCR和免疫荧光法检测BMSC诱导前后的定向分化标志基因,以探讨 PSCS对 BMSC定向诱导分化的效果。
  方法:
  1原代骨髓间充质干细胞分离培养
  采用全骨髓贴壁法,分离培养原代骨髓间充质干细胞。麻醉处死SD大鼠(约80g),将股骨取出,放入装有PBS的平皿中,冲洗3次。剪除股骨近端骨骺,用5 mL注射器吸取5%FBS-MSCM培养基,从远端骨骺洞隙进针,反复冲洗骨髓腔,直到股骨变为苍白色。轻柔吹打骨髓液,室温800 rpm离心5 min。PBS冲洗2次,加入2~3 mL培养基,接种培养瓶中。37℃培养。24 h后全量换液,换液时用PBS冲洗两次,去除杂细胞,约5~7 d细胞密度达到80%,可进行第一次传代。其后每次约2~3 d即可传代。光镜观察细胞形态变化。
  2流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞
  收集P3代生长状态良好的细胞,胰酶消化,1000 rpm离心5 min,用PBS洗涤细胞3次,细胞计数后,各管中分别依次加入CD105、CD90、CD44、CD34、CD45抗体,同时每管样品设立同型对照。避光室温孵育40 min,PBS清洗细胞3次,以除去未结合抗体,加入500μL PBS重悬细胞,流式细胞仪进行检测分析。
  3原代胰腺干细胞提取培养
  采用胶原酶消化联合差速贴壁法,分离培养原代胰腺干细胞。麻醉处死SD乳鼠,取出胰芽,放入盛有预冷的PBS的青霉素玻璃瓶中,用PBS轻柔冲洗3次,去除PBS。加入500μL预热的0.5 mg/mL胶原酶V,在37℃水浴中轻柔晃动10 min,反复消化,收集上清液,直到组织变为细沙状。在收集的上清液中加入5%FBS-hanks液,终止消化,轻柔吹打成细胞悬液。将细胞悬液室温800 rpm离心5 min,沉淀用Hanks液冲洗两次,反复离心洗涤3次后,沉淀加入3 mL5%FBS-1640培养基轻柔吹打,移入培养瓶中,37℃培养。提取之后每隔1 h将上层悬浮细胞转入新瓶。收集3、4次差速贴壁后的细胞,培养。2~3d后细胞呈现鹅卵石样,继续培养1~2 d,细胞密度基本达到80%,即可传代。光镜观察细胞形态变化。
  4免疫荧光法鉴定胰腺干细胞
  将生长状态良好的P2代细胞接种于预先放有灭菌玻片的六孔板中,生长24小时,融合至80%后将玻片取出,进行Nestin和Ngn3的细胞免疫荧光染色,以检测其分布和表达情况。
  5胰腺干细胞与骨髓间充质干细胞共培养
  在成功分离培养骨髓间充质干细胞和胰腺干细胞的基础上,实验分为:骨髓间充质干细胞(BMSC)组、胰腺干细胞(PSCS)组、共培养(Co-Culture, CC)组。BMSC组:收集P3代BMSC,以1×106的密度接种于六孔板内。PSCS组:收集P2代PSCS,以1×106的密度接种于六孔板内。CC组:BMSC以1×106的密度接种于六孔板内,PSCS以1×106的密度接种于Transwell小室中,建立BMSC和PSCS的共培养模型。共培养10 d后检测胰腺干细胞标志Nestin和Ngn3表达情况。
  6 RT-PCR方法检测nestin、ngn3的mRNA表达水平
  Trizol一步法分别提取各组 Transwell小室下层细胞中总 RNA,用RT-PCR方法检测nestin、ngn3 mRNA表达。用β-actin做内参。
  7免疫荧光法检测Nestin、Ngn3的表达情况
  共培养后,免疫荧光法鉴定各组Transwell小室下层细胞的Nestin、Ngn3蛋白的表达情况。
  结果:
  1原代骨髓间充质干细胞的形态变化
  刚分离提取的细胞悬浮于培养基中,呈球形;24 h全量换液时观察细胞开始贴壁生长,但大部分细胞仍为圆形;72 h之后部分细胞开始出现突起和伪足,形态呈多角形,并呈现集落式生长;传至P3代,形态大部分为长梭形、类成纤维样,并呈漩涡样生长。
  2流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞
  流式细胞仪检测结果显示,P3代BMSC均表达干细胞标志分子CD44、CD90、CD105,阳性率分别为89.4%、94.5%、99.8%,而造血细胞分子标志CD34、CD45呈阴性表达,阳性率分别为9.48%、8.22%。说明提取培养的原代细胞为骨髓间充质干细胞。
  3原代胰腺干细胞的形态变化
  刚分离提取的细胞悬浮于培养基中,由于胶原酶 V消化后的细胞中含有大量的成纤维细胞,并且成纤维细胞较胰腺干细胞易贴壁,因此每隔1h差速贴壁1次;差速2~3次后可见前几瓶细胞大量贴壁,并呈长梭形,乃典型成纤维细胞。此后的细胞在24 h后呈现鹅卵石样,贴壁生长。
  4免疫荧光法鉴定胰腺干细胞
  免疫荧光法检测结果显示, P2代胰腺干细胞明显表达其标志分子Nestin、Ngn3蛋白。说明提取培养的原代细胞为胰腺干细胞。
  5共培养后各组nestin、ngn3的mRNA表达情况
  与骨髓间充质干细胞组比,PSCS组及CC组nestin及ngn3 mRNA水平均显著升高(P<0.05),有统计学差异。与PSCS组比,CC组nestin mRNA水平显著降低(P<0.05),有统计学差异。与PSCS组比,CC组ngn3 mRNA水平无统计学差异(P>0.05)。说明与 PSCS共培养后,骨髓间充质干细胞表达胰腺干细胞标志基因nestin及ngn3。
  6共培养后细胞的Nestin、Ngn3的表达情况
  与骨髓间充质干细胞组比,PSCS组及CC组Nestin及Ngn3蛋白细胞分布明显,且含量均显著升高(P<0.01),有统计学差异。与 PSCS组相比,CC组Nestin及Ngn3蛋白分布和含量无明显差异(P>0.05)。说明与 PSCS共培养后,骨髓间充质干细胞中胰腺干细胞标志 Nestin及Ngn3蛋白被诱导合成,向胰腺细胞方向分化。
  第二部分:定向诱导分化的骨髓间充质干细胞对糖尿病胰岛的修复作用
  目的:糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是一种全球范围内的流行病,因体内胰岛素相对或绝对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低或胰岛素本身存在结构上的缺陷而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的一种慢性疾病,其基本特征为血糖水平升高。目前,糖尿病的治疗主要以降血糖类药物为主,但药物治疗并未取得满意的治疗效果,只是控制血糖的水平,并未从根本上解决胰腺组织胰岛功能不足的问题。近年来随着再生医学研究领域的发展,干细胞治疗逐步兴起,这为解决上述难题提供了新思路。
  骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem,BMSC)是一种在组织工程、再生医学和自身免疫疾病治疗方面理想的种子细胞。然而直接移植BMSC往往由于靶向性不足而使得治疗效果不佳。
  胰腺干细胞(pancreatic stem cells,PSCS)是一类存在于胎儿和成年胰腺组织中的成体干细胞,是保持着未达终末分化状态的具有自我更新和多分化潜能的细胞。但是由于胰腺干细胞来源十分匮乏,并且存在免疫排斥等问题,直接移植或者诱导其形成类胰岛样细胞团后移植往往达不到理想的治疗效果。
  本实验用胰腺干细胞(PSCS)诱导骨髓间充质干细胞(BMSC)定向分化后,尾静脉注射糖尿病大鼠,以探讨其对糖尿病胰岛功能的修复作用。
  用健康雄性SD大鼠进行实验,链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)复制 DM模型,各治疗组尾静脉注射细胞,测定血糖、体重变化,测定糖耐量曲线,利用 DIR-碘化物染色细胞并示踪;并取大鼠胰腺于光镜下进行形态学观察,利用 ELISA试剂盒检测大鼠血清胰岛素、C肽含量,利用糖原检测试剂盒检测大鼠肝糖原、肌糖原含量,利用Western blot方法检测大鼠胰腺组织胰岛素蛋白表达情况,旨在进一步探讨诱导后细胞逆转DM的整体功效及作用,为临床治疗提供实验依据。
  方法:
  1.动物分组与取材
  健康雄性SD大鼠60只,随机分为5组,正常组(Con)5只,其余55只腹腔注射STZ溶液制备DM模型。注射3天后,测空腹血糖高于16.7 mmol/L,为造模成功。造模成功45只,再将其随机分成4组:病理组(DM,9只),PBS组(PBS,5只),BMSC组(BMSC,15只),共培养组(CC,16只)。以上4组均20-25℃室温下喂养。BMSC组、共培养组尾静脉注射各组细胞5×106个,每两周注射1次,共3次。饲养5周后,麻醉处死。
  2.测血糖和体重
  耳缘静脉取血,用血糖仪检测并记录注射STZ前、后1周、2周、3周、4周、5周的血糖变化。并记录注射STZ前、后1周、2周、3周、4周、5周的体重变化。
  3.检测糖耐量的变化
  第2次注射细胞后第7天上午(觅食结束),将大鼠禁食6 h。6 h后耳缘静脉采血,用血糖仪检测血糖并记录,然后腹腔注射葡萄糖(100 mg/mL,注射剂量按1 mg/g体重给予)。分别在注射即刻、0.25 h、0.5 h、1h、2h时间点测血糖并记录,用于描绘糖耐量曲线。
  4.细胞标记与示踪
  DIR-碘化物染色细胞,尾静脉注射7天后活体成像仪拍照。
  5.光镜下观察胰腺组织形态学变化
  取胰腺组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片及 HE染色,光镜下观察胰腺形态学变化。
  6.胰岛素ELISA试剂盒检测大鼠血清胰岛素含量
  7.C肽ELISA试剂盒检测大鼠血清C肽含量
  8.糖原检测试剂盒检测大鼠肝糖原、肌糖原含量
  9.Western blot方法检测大鼠胰腺组织胰岛素蛋白表达情况
  结果:
  1.大鼠的一般表现以及血糖和体重变化情况
  造模成功的大鼠逐渐出现消瘦,皮毛无光泽、疏松,反应迟钝,多饮、多尿、多食、生长迟缓等症状。随着实验进行,DM组和 PBS组体征更加明显,而BMSC组及CC组明显有好转。
  各组大鼠入选时血糖和体重无显著性差异。整个实验中,BMSC组及CC组平均体重均无显著性差异(P>0.05),以上两组均显著高于DM组及PBS组(P<0.01)。
  BMSC组及CC组平均体血糖均无显著性差异(P>0.05),以上两组均显著低于DM组及PBS组(P<0.01)(Fig.1)。
  2.大鼠糖耐量实验
  与DM组、PBS组相比,BMSC组及CC组糖耐量曲线变化明显较优(P<0.01)(见Fig.2)。
  3.细胞标记与示踪
  活体成像结果显示,移植后的细胞可在体内腹部集中。
  4.光镜下观察胰腺组织形态学变化
  Con组:胰岛数目较多,轮廓规则整齐,胰岛体积大,胰岛内细胞排列整齐,细胞核居中,胞浆均匀,细胞界限清楚
  DM组及 PBS组:胰岛数目中度至重度减少,胰岛体积中度至重度减小,细胞空泡变性,细胞核偏向一侧,可见调亡。
  BMSC组:胰岛数目中度减少,胰岛体积中度减小,胰岛内细胞数减少,可见空泡变性。
  CC组:胰岛数目较多,胰岛体积轻度减小,胰岛内细胞数轻度减少,偶见空泡变性,胞浆较均匀。
  5.ELSIA检测各组大鼠血清中胰岛素、C肽含量的变化
  与Con组比,DM组、PBS组、BMSC组、CC组胰岛素及C肽水平显著降低(P<0.05),具有统计学差异。与BMSC组比CC组胰岛素水平明显升高(P<0.05),具有统计学差异。
  6.糖原检测试剂盒检测大鼠肝糖原、肌糖原含量的变化
  与Con组比,DM组、PBS组、BMSC组、CC组肝糖原及肌糖原水平显著降低(P<0.05),具有统计学差异。与BMSC组比CC组肝糖原水平明显升高(P<0.05),具有统计学差异,而与BMSC组比CC组肌糖原水平并无统计学差异(P>0.05)。
  7.Western Blot法检测大鼠胰岛素含量的变化
  与Con组比,DM组及PBS组胰岛素水平显著降低(P<0.05),均有统计学差异。而与Con组比CC组胰岛素水平并无统计学差异(P>0.05)。
  结论:
  1.与胰腺干细胞共培养,可成功诱导骨髓间充质干细胞定向分化为胰腺干细胞样细胞。
  2.BMSC可以有效改善糖尿病大鼠病情。
  3.诱导分化的骨髓间充质干细胞,对糖尿病胰岛功能的修复作用靶向性更好。
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作者: 张菁
授予学位: 硕士
学位授予单位: 河北医科大学
导师姓名: 齐锦生
学位年度: 2017
语 种: chi
分类号: R587.1
在线出版日期: 2018年1月19日