蛋白质SUMO化修饰在低温与高热应激条件下的细胞保护功能研究
目的:<br>  研究神经元中小泛素样修饰蛋白在低温及热应激条件下的变化特点和规律,并将该规律应用于中枢神经系统疾病中,发挥其神经保护作用,达到救治与温度应激相关的中枢神经系统疾病的目的。<br>  方法:<br>  (1)①原代分离培养小鼠源性BMSCs,流式细胞术鉴定其细胞表面标记蛋白的表达;②分别将其置于37℃(正常体温)、33℃(亚低温)及18℃(深低温)培养环境中,MTT方法检测BMSCs细胞增殖活性,流式细胞术检测BMSCs细胞周期变化,细胞免疫荧光方法检测其在不同温度条件下向神经元和神经胶质细胞的分化潜能改变情况;③建立神经元OGD模型,细胞原位凋亡方法检...
目的:
  研究神经元中小泛素样修饰蛋白在低温及热应激条件下的变化特点和规律,并将该规律应用于中枢神经系统疾病中,发挥其神经保护作用,达到救治与温度应激相关的中枢神经系统疾病的目的。
  方法:
  (1)①原代分离培养小鼠源性BMSCs,流式细胞术鉴定其细胞表面标记蛋白的表达;②分别将其置于37℃(正常体温)、33℃(亚低温)及18℃(深低温)培养环境中,MTT方法检测BMSCs细胞增殖活性,流式细胞术检测BMSCs细胞周期变化,细胞免疫荧光方法检测其在不同温度条件下向神经元和神经胶质细胞的分化潜能改变情况;③建立神经元OGD模型,细胞原位凋亡方法检测BMSCs的细胞凋亡情况,ELISA实验检测LDH含量;western blot方法检测共价结合状态及游离状态的SUMO1和SUMO2/3的蛋白表达情况;细胞免疫荧光方法检测SUMO1和SUMO2/3在BMSCs中的细胞定位变化;④siRNA技术沉默BMSCs中SUMO1/2/3的基因表达,利用壮观霉素B1抑制Ubc9的基因表达,并将其置于不同温度下观察其细胞形态、细胞增殖活性、向神经细胞分化以及耐受OGD环境能力的变化;western blot方法检测PCNA、Oct4、P53、HIF-1α的蛋白表达水平,分析低温诱导 SUMO活化保护 BMSCs耐受乏氧不利环境的可能机制。
  (2)①免疫荧光双染方法和western blot方法鉴定SUMO1/2/3基因敲除及SUMO1/2/3转基因小鼠的基因型;②原代分离和培养小鼠胎鼠大脑皮层神经元细胞,将其分别置于37℃(正常体温)、42℃(高热)及47℃(超高热)培养环境中,western blot方法检测SUMO1和SUMO2/3的蛋白表达水平,免疫荧光方法检测SUMO1和SUMO2/3蛋白在神经元中的细胞定位;③细胞原位凋亡方法检测野生型、SUMO1/2/3基因敲除型及SUMO1/2/3转基因型神经元在上述温度下的细胞凋亡情况,ELISA方法检测上清液中LDH含量;④制作小鼠热惊厥模型,五点量表法进行惊厥发作评分,记录小鼠惊厥百分率、潜伏时间和惊厥持续时间。
  结果:
  (1)① BMSCs高表达间充质干细胞特异性蛋白CD71和CD105,而不表达造血干细胞特异蛋白CD34和CD4;②BMSCs在低温下生长缓慢,随着温度的降低其分化为神经细胞的能力逐渐降低;BMSCs在 OGD条件下可见大量细胞凋亡,伴随着高水平的乳酸脱氢酶释放,低温能够改善上述情况;③低温可以诱导大量的蛋白质被SUMOs修饰,表现为共价结合态SUMO1和SUMO2/3水平的明显升高,而游离SUMO1和SUMO2/3水平的下降,同时伴随着其从细胞质向细胞核的移位;④沉默SUMO1/2/3基因表达后BMSCs形态开始老化,细胞生长速度明显减慢,细胞周期停滞,并向神经细胞发生终末分化;壮观霉素 B1能够在一定程度上抑制 Ubc9的表达,进而降低共价结合状态的 SUMO1和SUMO2/3的蛋白水平,BMSCs增殖速度减缓,低温能够增加BMSCs对乏氧不利环境的耐受能力;壮观霉素B1能够降低PCNA、Oct4、P53、HIF-1α的蛋白表达水平。
  (2)①免疫荧光双染方法和western blot方法鉴定SUMO1/2/3基因敲除及SUMO1/2/3转基因小鼠的基因型在转基因小鼠神经元中稳定表达,性状稳定;②小鼠胎鼠大脑皮层神经元细胞置于37℃、42℃及47℃培养环境中时共价及游离状态的SUMO1蛋白表达水平没有明显变化,但共价结合状态的SUMO2/3的蛋白表达水平明显升高,相应地其游离状态SUMO2/3的蛋白表达水平下降;免疫荧光结果显示SUMO2/3蛋白存在由细胞浆向细胞核的移位;上述现象在自42℃回复到37℃后能够得到恢复,但自47℃回复到37℃后不能完成恢复;③与野生型小鼠源性的神经元相比较,SUMO1/2/3基因敲除神经元在高热应激条件下具有更高的细胞凋亡和LDH水平,而SUMO1/2/3转基因神经元能够明显增加其对高热应激的耐受程度;④小鼠热惊厥模型检测结果显示,与野生型小鼠相比较,SUMO1/2/3基因敲除小鼠的惊厥评分、惊厥发作百分率、潜伏时间和惊厥持续时间均最高,而SUMO1/2/3转基因小鼠的惊厥评分、惊厥发作百分率、潜伏时间和惊厥持续时间均最低。
  结论:
  (1)低温能够抑制 BMSCs的增殖能力,降低其向神经细胞的分化潜能,同时能够增加其对乏氧微环境的耐受程度;
  (2)低温能够增加 BMSCs中大量蛋白质的 SUMO化修饰水平,并诱导SUMO1和SUMO2/3从细胞浆向细胞核移位;
  (3)SUMOs通路的活化对于BMSCs的增殖和干性维持是必不可少的;
  (4)壮观霉素B1能够通过抑制Ubc9基因表达抑制SUMOs通路,进而降低BMSCs对乏氧微环境的耐受能力。
  (5)低温能够增加PCNA、Oct4、P53、HIF-1α蛋白的SUMO化修饰水平,上述机制共同参与BMSCs在低温环境下的增殖能力、干性维持能力以及对乏氧不利微环境的耐受能力;
  (6)SUMO2/3(而非SUMO1)参与介导神经元热应激早期反应;
  (7)短时间的高热应激(42℃)诱导的SUMO2/3共价修饰反应是可逆的,而超高温度的热应激(47℃)诱导的SUMO2/3共价修饰反应是不可逆的;
  (8)增加神经元中 SUMOs过表达能够使其耐受更高程度的热应激环境,降低其发生热惊厥的几率。
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作者: 刘晓智
学科专业: 临床医学
授予学位: 博士
学位授予单位: 天津医科大学
导师姓名: 杨新宇
学位年度: 2017
语 种: chi
分类号: R742
在线出版日期: 2019年3月27日