绵羊羊膜上皮细胞的分化潜能及在骨缺损模型治疗中的应用
羊膜上皮细胞(amnion epithelial cells,AECs)是由废弃的胎盘羊膜衍生的具有干细胞特性的细胞。AECs不仅具有多向分化潜能,而且许多研究都证实其具有免疫豁免性,移植后不产生免疫排斥反应,因缺乏末端转移酶端粒,移植后不致瘤,再加上来源广、易获得,不存在伦理争议等,而成为细胞研究工作者的研究热点之一。应用AECs进行一些疑难症的治疗是临床研究工作者的最终目标。临床应用治疗顺利进行的前提是以安全可靠的动物实验为基础。目前,AECs的研究主要以人的为主,在临床治疗研究中以人AECs治疗肝病、肺病、心脏病、糖尿病、神经系统疾病等疑难病症。而绵羊AE...
羊膜上皮细胞(amnion epithelial cells,AECs)是由废弃的胎盘羊膜衍生的具有干细胞特性的细胞。AECs不仅具有多向分化潜能,而且许多研究都证实其具有免疫豁免性,移植后不产生免疫排斥反应,因缺乏末端转移酶端粒,移植后不致瘤,再加上来源广、易获得,不存在伦理争议等,而成为细胞研究工作者的研究热点之一。应用AECs进行一些疑难症的治疗是临床研究工作者的最终目标。临床应用治疗顺利进行的前提是以安全可靠的动物实验为基础。目前,AECs的研究主要以人的为主,在临床治疗研究中以人AECs治疗肝病、肺病、心脏病、糖尿病、神经系统疾病等疑难病症。而绵羊AECs的研究在国内尚未见报道,国外的相关研究也极少。因此,本研究对绵羊AECs的分离培养、干细胞特性的鉴定、体内分化及体外定向诱导分化进行了系统的研究。
  1.绵羊羊膜上皮细胞的分离与培养
  实验参照人羊膜消化分离获得原代细胞的方法,对绵羊羊膜的消化分离方法进行了探索,最终选用胰酶替代物TrypLE消化绵羊羊膜分离获得原代细胞,获得的原代细胞活力高,纯度好。细胞培养过程中选用了15%的胎牛血清浓度的培养液进行细胞的培养,很好地维持细胞良好的生长态势。
  在不同密度梯度培养情况下,通过观察比较,确定了细胞接种的最适密度培养密度范围。在最适密度培养范围内,进行细胞生长周期的观察发现:绵羊AECs的潜伏期是1-2d,指数生长期是3-5d,以后为平台期。
  通过细胞冻存实验确定了细胞的冻存方案,采用DMSO作为冻存保护剂,FBS:DMSO=9:1的比列为冻存液,并且取-80℃到液氮的简捷冻存途径,有效地保存了绵羊AECs。
  2.绵羊羊膜上皮细胞的干细胞特性的鉴定
  采用细胞免疫荧光和RT-PCR技术分别检测绵羊 AECs的ES细胞表面标志物Oct-4、SSEA-1、 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81及干细胞全能性相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Rex-1等。检测结果显示绵羊AECs的Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的ES细胞标志物均有表达。干细胞全能性相关基因Oct-4、Sox-2和Rex-1表达,而Nanog基因未见表达。检测结果提示,绵羊AECs具有干细胞特性的多向分化潜能。
  3.绵羊羊膜上皮细胞在体外的定向诱导分化研究
  为了检验绵羊AECs在体外的多向分化潜能,在一定条件下,利用一些外源因子诱导绵羊AECs向神经系统细胞、成骨细胞和脂肪细胞进行定向分化。然后分别用细胞免疫荧光检测和RT-PCR技术、细胞AKP活性检测、茜素红染色、油红O染色等方法进行了诱导分化细胞的鉴定。结果显示:①神经方向诱导分化28d后,细胞免疫荧光显示神经细胞特异性标志物β-III-tubulin和神经胶质细胞特异性标志物GFAP均呈阳性表达;RT-PCR显示nestin和β-III-tubulin和MAP-2等基因均有表达。②成骨诱导分化细胞AKP活性检测显示,诱导分化培养的第28d细胞AKP活性略有升高,第35d开始明显高于对照组,而且随培养时间的延长而继续增高,诱导组和基础培养组差异显著;茜素红染色有明显的钙化结节形成。③脂肪细胞诱导分化的第42d,油红O染色观察到有脂滴形成;细胞内AKP活性检测结果显示,基础培养组细胞AKP活性最高,各诱导组细胞AKP活性明显低于基础培养组。从上述鉴定中细胞的阳性及染色结果和诱导分化细胞的形态特征,可以推测本研究可以将绵羊AECs诱导分化为了表达β-III-tubulin阳性的未成熟神经细胞及MAP-2阳性的成熟神经细胞、GFAP阳性的神经胶质细胞,有钙化结节形成的成骨细胞及有脂滴形成的脂肪细胞。
  4.绵羊羊膜上皮细胞治疗兔桡骨缺损模型的研究
  国外有文献报道,将绵羊AECs直接注射到绵羊体内,来治疗绵羊跟腱损伤的报道,且治疗效果极佳。为了进一步检验我们获得的绵羊AECs是否能够在异种动物兔体内进行分化,从而达到类似的治疗效果。手术制作30只兔桡骨13mm缺损模型,随机分成3组,即高剂量组,低剂量组和对照组。将AECs处理后,按设定剂量通过静脉注射进行细胞移植。在细胞移植前、手术后、细胞移植后2周、4周、8周拍摄X光片,细胞移植后的2周、4周、8周进行组织形态学观察。结果提示:移植的绵羊AECs高剂量组在第8周无论从X光片还是新生骨组织切片,缺损组织都修复完好,高剂量组优于低剂量组,低剂量组修复效果优于对照组。因此可以推测绵羊AECs在兔桡骨缺损模型的体内,向成骨方向进行了分化,加速了骨缺损的修复速度和质量。提示绵羊AECs治疗小段骨缺损是可行的。
  综上,本研究成功获得了具有干细胞特性的绵羊 AECs,其无论在体内还是在体外均具有多向分化能力。本研究结果补充了绵羊AECs在干细胞特性方面及在体内和体外分化的理论知识,为临床进一步应用研究奠定了理论基础,提供了实践依据。
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作者: 朱雪敏
学科专业: 基础兽医学
授予学位: 博士
学位授予单位: 内蒙古农业大学
导师姓名: 曹贵方
学位年度: 2012
语 种: chi
分类号: S858.26
在线出版日期: 2013年9月18日