肝源性nestin阳性细胞诱导分化为胰岛β细胞治疗1型糖尿病的研究
在动物胎肝内存在着大量具有繁殖和分化能力的干细胞。本课题应用免疫组化、细胞培养、分子克隆、RT-PCR、放射免疫等技术研究近年来干细胞领域的热点问题——(1)干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞(2)干细胞移植。着重研究胎鼠肝脏内nestin阳性细胞的诱导和分化,从体外分离培养出nestin阳性细胞,并使其形成胰岛样细胞团,表达胰岛素,证明其具有干细胞特点。全文共分三个部分。 第一部分: (1)SD大鼠胎肝干细胞的分离和培养。 胎肝干细胞的分离方法使用我们独创的机械分离法结合悬滴培养法,固定孕鼠四肢,切开腹腔,暴露呈“Y”形的子宫,胚胎连同子宫...
在动物胎肝内存在着大量具有繁殖和分化能力的干细胞。本课题应用免疫组化、细胞培养、分子克隆、RT-PCR、放射免疫等技术研究近年来干细胞领域的热点问题——(1)干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞(2)干细胞移植。着重研究胎鼠肝脏内nestin阳性细胞的诱导和分化,从体外分离培养出nestin阳性细胞,并使其形成胰岛样细胞团,表达胰岛素,证明其具有干细胞特点。全文共分三个部分。 第一部分: (1)SD大鼠胎肝干细胞的分离和培养。 胎肝干细胞的分离方法使用我们独创的机械分离法结合悬滴培养法,固定孕鼠四肢,切开腹腔,暴露呈“Y”形的子宫,胚胎连同子宫放入含75%的酒精清洗1分钟后,拿入超净台。用镊子撕开胎膜取出胚胎,逐个撕开皮肤取出胎肝,然后将之放入4℃D-Hanks平衡液的青瓶中,粗剪,再漂洗3次后,吸去多余血细胞和液体。滴加2-3滴高糖DMEM细剪成1MM<'3>。大小的组织,加入D-Hanks平衡液收集单细胞悬液,静置20-30min后弃上层血细胞,以700rpm的速度离心5min,除去上清液,收集沉淀细胞。用D-hanks液重悬细胞移入培养皿中,加入沉淀细胞两倍左右的胰酶-EDTA消化酶,混匀后在显微镜下观察细胞形态,当细胞变圆,有白色絮状沉淀时说明消化合适,加入少许D-hanks液终止消化,将消化后的细胞离心,以30μl/滴(0.5×10<'5>/ml)的密度接种在100mm<'3>培养皿的上盖,在无血清添加生长因子的高糖DMEM培养基中,37℃,5%CO<,2>,饱和湿度条件下培养,1天后换液,主要是清除血细胞等未贴壁细胞,2天以后就倒置悬浮培养(培养皿中加入少许PBS),每天取出半量换液,待细胞融合达到4/5时,用胰蛋白酶消化,按1:2-1:3的比例传代。可获得形态功能良好的大量的胎肝干细胞。简化了干细胞分离步骤,减少了污染机会,有利于进一步的培养。 (2)巢蛋白(nestin)在胎肝干细胞的扩增。 本课题摸索出一套较好的诱导方法,添加烟酰胺10mmol/L,胰岛素1mg/L,N<,2>添加剂,碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、干细胞因子(stem cell factor,SCF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)各20μg/L,实验证明通过部分模拟胎肝组织的内环境,进而促进胎肝干细胞的大量增殖,为体外大量扩增提供可靠的实验依据。二硫腙是一种锌离子獒合剂,能特异性地与胰岛β细胞中的锌离子结合,使B细胞呈红色,通过对克隆形成的nestin阳性细胞在高糖环境下进行二硫腙染色,也证明了nestin阳性细胞有分化为胰岛细胞的潜力,具有干细胞的特点。 第二部分:糖尿病鼠模型的确立。 探讨链脲佐菌素(streptozocin,STZ)致大鼠1型糖尿病模型建立的方法。本研究采取国际上流行的腹腔注射链脲佐菌素破坏胰岛功能,结合高糖高脂饮食,通过改良,调整链脲佐菌素的剂量和浓度,通过随机血糖检测提示能使糖尿病大鼠能保持稳定的高血糖状态,实验证明糖尿病大鼠造模成功率在90%以上,为糖尿病的研究提供一个合适的动物模型。 第三部分:干细胞移植治疗糖尿病。 干细胞的全能性为研究糖尿病的细胞治疗开辟了新途径。本研究采取从12-15天的胎鼠肝内分离,培养出胎肝干细胞,在高糖体外培养条件下横向分化能表达nestin抗体的细胞,聚集成胰岛样细胞团,并能表达与胰岛细胞分化相关的转录因子及胰岛特有的激素,当受到葡萄糖刺激时,能在烟酰胺的作用下合成分泌胰岛素,从理论上来说可以逆转糖尿病大鼠的高血糖状态。以上研究说明,烟酰胺和高浓度葡萄糖作用诱导下,肝卵圆细胞可以向胰腺内分泌细胞的方向分化,并且能表达胰岛素。认为,肝卵圆细胞定向向胰岛素分泌细胞诱导分化可能有两种情况:(1)、肝卵圆细胞本身就能表达nestin,本身也具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,在正常情况下也有少部分肝卵圆细胞向胰岛素分泌细胞转化;(2)、烟酰胺和高浓度葡萄糖再加上各种生长因子,能启动肝卵圆细胞PDX-1基因的表达,极大程度上模拟了胚胎时期胰腺干细胞生长和发育环境,使其向胰岛素分泌细胞的方向分化。卵圆细胞内nestin阳性细胞能定向诱导分化胰岛素分泌细胞就是这两个因素共同作用的结果。最后,我们诱导后获得的细胞对糖尿病大鼠模型进行细胞移植,若能完全治愈糖尿病,还需要我们科学工作者长期、艰苦的努力。
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作者: 刘军
学科专业: 解剖与组织胚胎学
授予学位: 硕士
学位授予单位: 南方医科大学
导师姓名: 安靓
学位年度: 2007
语 种: chi
分类号: R587.105 R457.7
在线出版日期: 2007年11月12日