电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化的影响及其作用机制的研究
缺血性脑卒中是神经系统的常见病和多发病,在脑卒中约占75%。大多数患者中遗留有瘫痪、失语等严重后遗症,给患者带来极大的痛苦,同时也给社会和家庭带来沉重的负担。脑缺血/再灌注损伤使脑组织的功能障碍和结构损伤更加严重,使治疗效果大大降低。因此如何采取合理的措施预防和治疗缺血性脑血管病,恢复受损神经细胞功能,降低致残率和病死率,近年来已成为医学界关注的热点课题。脑缺血/再灌注损伤是一复杂的病理生理过程,神经元结构破坏和缺失可能是引起功能障碍的病理关键。目前还没有理想的治疗脑缺血/再灌注损伤的方法。研究发现电刺激小脑顶核对神...
缺血性脑卒中是神经系统的常见病和多发病,在脑卒中约占75%。大多数患者中遗留有瘫痪、失语等严重后遗症,给患者带来极大的痛苦,同时也给社会和家庭带来沉重的负担。脑缺血/再灌注损伤使脑组织的功能障碍和结构损伤更加严重,使治疗效果大大降低。因此如何采取合理的措施预防和治疗缺血性脑血管病,恢复受损神经细胞功能,降低致残率和病死率,近年来已成为医学界关注的热点课题。脑缺血/再灌注损伤是一复杂的病理生理过程,神经元结构破坏和缺失可能是引起功能障碍的病理关键。目前还没有理想的治疗脑缺血/再灌注损伤的方法。研究发现电刺激小脑顶核对神经系统疾病有神经保护作用,可以抗炎症、抑制细胞凋亡、促进神经组织的结构重建等作用。目前,采用仿生物电,模拟实验性小脑顶核电刺激而研制的小脑电刺激仪已广泛应用于许多神经系统疾病的临床治疗,对多种中枢神经系统疾病都产生了比较肯定的临床效果。Notch1是控制细胞命运的信号传导途径。当Notch1被激活后,神经干细胞进行增殖,而当Notch1活性被抑制时,干细胞则进入分化程序。bHLH基因转录调控因子(包括Hes5和Mash1)是指由一个碱性螺旋-环-螺旋结构及其上游富含碱性氨基酸序列的核酸顺序组成的一类基因,可以调控许多基因的转录。研究表明,Hes5信号通路能抑制神经干细胞向神经元方向分化,促进神经干细胞增殖。Mash1的高表达可促进干细胞的分化,相反低表达则抑制干细胞的分化,使干细胞处于持续的增殖状态。核转录因子-κB对神经干细胞增殖分化作用机制十分复杂,通过对众多涉及炎症和免疫反应等方面的基因调控来影响神经干细胞增殖分化。基于以往实验研究与临床的成果,本实验从电刺激小脑顶核干预局灶脑缺血/再灌注损伤内源性神经干细胞的研究入手,进一步探讨电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注损伤脑组织神经干细胞的增殖分化的影响及其作用机制,为缺血性脑血管病的治疗提供实验基础。 目的: 1.观察电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注神经行为学、神经功能缺损的影响以及脑组织的含水量、脑梗死体积的变化。 2.观察局灶脑缺血/再灌注各时间点大鼠成体神经干细胞的增殖分化及电刺激小脑顶核对局灶脑缺血/再灌注大鼠成体神经干细胞的增殖分化的影响,探讨电刺激小脑顶对局灶脑缺血/再灌注后神经重建的作用。 3.观察电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑缺血侧皮质Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65 mRNA和蛋白表达的变化,进一步探讨电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后脑内成体神经干细胞增殖分化影响的作用机制。 方法: 1.改良线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶脑缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠随机分为正常对照组(N组),假手术组(S组),缺血/再灌注组(I/R组),缺血/再灌注后小脑顶核假刺激组(SF组),缺血/再灌注后小脑顶核刺激(F)组。根据再灌注时间的不同又分为1d、3d、7d3个亚组。对大鼠进行神经功能缺损评分以及测量脑组织的含水量、脑梗死体积的变化。 2.制备大脑中动脉局灶脑缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠随机分为正常对照组(N组),假手术组(S组),缺血/再灌注组(I/R组),缺血/再灌注后小脑顶核刺激(F)组。根据再灌注时间的不同又分为3d、7d、14d、28d4个亚组,每个亚组动物数n=7只。免疫荧光单标和双标法检测研究局灶脑缺血/再灌注及电刺激小脑顶核对缺血/再灌注大鼠神经干细胞的增殖的动态变化和分化的结果。 3.改良线栓法制备大脑中动脉局灶脑缺血1.5h再灌注模型。成年SD大鼠随机分为假手术组(S组),缺血/再灌注组(I/R组),缺血/再灌注后小脑顶核刺激(F)组。根据再灌注时间的不同又分为14d、28d2个亚组,每个亚组动物数n=7只。采用RT-PCR和Western blotting检测局灶脑缺血/再灌注及电刺激小脑顶核对大鼠局灶脑缺血/再灌注后Notch1、Hes5和Mash1 mRNA及蛋白的表达,采用RT-PCR和免疫组化技术检测NF-κB p65 mRNA及蛋白的表达。 结果: 1.电刺激小脑顶核能提高局灶脑缺血/再灌注大鼠的神经功能缺损评分,降低缺血侧脑组织中脑含水量,缩小脑梗死体积。 2.正常对照组和假手术组侧脑室区和缺血周围皮质只存在少量Brdu阳性细胞,局灶脑缺血/再灌注脑损伤后3d大鼠侧脑室下区Brdu阳性细胞显著增加(P<0.01),7d时增加达到顶锋(P<0.01),14d和28d时后Brdu阳性细胞仍增加(P<0.01);局灶脑缺血/再灌注脑损伤后3d大鼠缺血周围皮质Brdu阳性细胞也显著增加(P<0.001),7d时增加达到顶峰(P<0.001),14d和28d时后Brdu阳性细胞仍显著增加(P<0.001);电刺激小脑顶核后大鼠侧脑室下区和缺血周围皮质Brdu阳性细胞增加更明显,与缺血/再灌注组比较,在3d、7d、14d和28d四个时间点Brdu阳性细胞增加更多,均有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光双标法显示在正常组、假手术组仅见极少量Brdu/GFAP和Brdu/DCX双阳性细胞,缺血/再灌注组可见少量Brdu/GFAP和Brdu/DCX双阳性细胞,小脑顶核刺激组可见大量Brdu/GFAP和Brdu/DCX双阳性细胞,Brdu/GFAP和Brdu/DCX双阳性细胞明显增多,主要分化为神经元和神经胶质细胞。 3.与假手术组比较,脑缺血/再灌注组和脑缺血/再灌注后小脑顶核刺激组Notch1、Hes5、Mash1 mRNA和蛋白的表达量均增加(P<0.01);与脑缺血/再灌注组比较,小脑顶核刺激组Notch1、Hes5、Mash1 mRNA和蛋白的表达量增加更明显(P<0.05)。与假手术组比较,脑缺血/再灌注组和脑缺血/再灌注后小脑顶核刺激组NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达量均增加(P<0.01);与脑缺血/再灌注组比较,小脑顶核刺激组NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达量明显降低(P<0.05)。 结论: 1.成功建立改良线栓法大鼠局灶脑缺血/再灌注模型。电刺激小脑顶核可以降低脑缺血/再灌注损伤后急性期死亡率,促进肢体功能恢复。电刺激小脑顶核能提高大脑中动脉局灶脑缺血/再灌注模型大鼠的神经功能缺损评分,降低缺血侧脑组织中脑含水量,缩小脑梗死体积,从而达到脑保护作用 2.脑缺血后自身的神经干细胞也存在增殖。在正常对照组和假手术组大鼠SVZ和缺血侧皮质有少量神经干细胞,未见神经干细胞增殖。内源性神经干细胞增殖在脑缺血再灌注后逐渐升高,在脑梗死后7d达到高峰,以后增殖逐渐下降,28d神经干细胞仍有增殖。电刺激小脑顶核后神经干细胞增殖更明显,在7d达到高峰,28d后在SVZ和缺血周围皮质神经干细胞均还有明显增殖。电刺激小脑顶核能促进脑缺血后大鼠内源性神经干细胞的增殖。在正常组、假手术组仅见极少量神经干细胞分化,缺血/再灌注组可见少量神经干细胞分化,小脑顶核刺激组可见大量神经干细胞分化,分化明显增多,分化为神经胶质细胞和神经元。电刺激小脑顶核促进神经干细胞分化为神经胶质样细胞和神经元样细胞。电刺激小脑顶核通过促进内源性神经干细胞增殖和分化发挥脑组织神经重建作用。 3.正常成年大鼠脑组织Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65表达较少。局灶脑缺血/再灌注后,大鼠缺血侧脑皮质Notch1、Hes5、Mash1和NF-κB p65 mRNA及蛋白表达明显增强,电刺激小脑顶核后Notch1、Mash1和Hes5 mRNA及蛋白表达增强更明显,NF-κB p65 mRNA及蛋白表达增强则减弱。电刺激小脑顶核通过促进Notch1、Hes5和Mash1mRNA及蛋白表达和抑制NF-κB p65 mRNA及蛋白表达来影响神经干细胞增殖和分化。
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作者: 王咏龙
学科专业: 神经病学
授予学位: 博士
学位授予单位: 重庆医科大学
导师姓名: 罗勇
学位年度: 2009
语 种: chi
分类号: R743.31
在线出版日期: 2009年12月25日