体外诱导人羊膜细胞向神经细胞分化
目的:成体干细胞(Somatic stem cells,SSCs)移植作为治疗神经系统疾病新方法颇受关注,本研究旨在通过体外诱导实验,评价人羊膜干细胞(Human amnion-derivedstem cells,hAD-SCs)向神经细胞(Neural Cells,NCs)分化的能力,为hAD-SCs作为治疗神经系统疾病新的细胞供源提供实验依据。<br>   方法:①细胞分离及鉴定:采用胰酶-胶原酶两步消化法从足月分娩的人羊膜组织中分离人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)和人羊膜间充质干细胞(human amnion-derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs),用流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)和免疫...
目的:成体干细胞(Somatic stem cells,SSCs)移植作为治疗神经系统疾病新方法颇受关注,本研究旨在通过体外诱导实验,评价人羊膜干细胞(Human amnion-derivedstem cells,hAD-SCs)向神经细胞(Neural Cells,NCs)分化的能力,为hAD-SCs作为治疗神经系统疾病新的细胞供源提供实验依据。
   方法:①细胞分离及鉴定:采用胰酶-胶原酶两步消化法从足月分娩的人羊膜组织中分离人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)和人羊膜间充质干细胞(human amnion-derived mesenchymal stem cells,hAD-MSCs),用流式细胞仪(Flowcytometry,FCM)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,IC)法进行表型鉴定和细胞鉴定。②诱导培养条件:hAECs和hAD-MSCs均设诱导组和未诱导组。诱导组为含200mM L-Glu和1μmol/L全反式维甲酸(All-trans-retinoic acid,ATRA)的无血清HG-DMEM培养基,未诱导组为含200mM L-Glu和10%胎牛血清HG-DMEM培养基。在37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养48h或96h。③NSE阳性细胞百分率及神经元标志物检测:采用FCM分别检测hAECs和hAD-MSCs诱导后NSE阳性细胞百分率;采用IC和免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、神经丝(neurofilament,NF)、胶质纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神经微管蛋白(β-tubulin-Ⅲ)、微管结合蛋白2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)及神经元核蛋白(NeuronalNuclei,NeuN)的表达。实时聚合酶链反应(Real time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测NSE、NF、GFAP、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2及NeuNmRNA的表达。④采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测hAECs和hAD-MSCs培养上清液中多巴胺(DA)的含量。
   结果:①FCM和IC分析结果显示hAECs CK19表达阳性,低表达CD44,不表达CD71、CD34、CD45;而hAD-MSCs高表达CD44、CD29、CD90、CD73、CD105及波形蛋白阳性,不表达CD34、CD45、CD19、CD14和HLA-DR。②hAECs和hAD-MSCs诱导组细胞表达NSE百分率分别为61.16±19.8%和47.03±19.2%,而未诱导组几乎不表达。hAECs和hAD-MSCs诱导组表达NSE、NF、GFAP、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2及NeuN,而其未诱导组未见表达。hAECs和hAD-MSCs诱导组NSE、NF、GFAP、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2及NeuNmRNA的表达均高于未诱导组(P<0.05)③hAECs和hAD-MSCs诱导组上清液中DA含量分别为79.71±11.94ng/L和74.03±9.46ng/L,明显高于未诱导组(P<0.05)。
   结论:hAECs和hAD-MSCs均具有向NCs分化的能力,提示hAD-SCs可作为治疗神经系统疾病新的细胞供源。
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作者: 刘娟
授予学位: 硕士
学位授予单位: 遵义医学院
导师姓名: 陈代雄
学位年度: 2012
语 种: chi
分类号: R329.28
在线出版日期: 2012年11月30日