骨髓间质细胞与TNF-α损伤的PC12细胞之间相互作用及其相关机制的实验研究
目的:<br>  神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一种以神经元退行性病变为基础的慢性进行性神经系统疾病,虽然诱发此类疾病的病因和病变部位不尽相同,但不可忽视的是,脑内神经炎症与神经退行性疾病有着密不可分的联系。神经退行性疾病的共同特征是特定区域内神经元功能的丧失,即神经元不可逆的损伤、死亡。目前的药物治疗和外科手术均不能从根本上解决这一问题,随着细胞代替疗法的逐步发展,能否通过细胞移植来恢复神经通路中的神经元功能以治疗神经退行性病变,成为医疗界关注及研究的焦点。骨髓基质细胞(Bone marrow stromalcells,BMSC...
目的:
  神经退行性疾病(Neurodegenerative disease)是一种以神经元退行性病变为基础的慢性进行性神经系统疾病,虽然诱发此类疾病的病因和病变部位不尽相同,但不可忽视的是,脑内神经炎症与神经退行性疾病有着密不可分的联系。神经退行性疾病的共同特征是特定区域内神经元功能的丧失,即神经元不可逆的损伤、死亡。目前的药物治疗和外科手术均不能从根本上解决这一问题,随着细胞代替疗法的逐步发展,能否通过细胞移植来恢复神经通路中的神经元功能以治疗神经退行性病变,成为医疗界关注及研究的焦点。骨髓基质细胞(Bone marrow stromalcells,BMSCs)是来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,其移植后可修复神经元变性引起的神经传导通路损伤或者补充新的神经元。移植的干细胞能够起到治疗作用,很可能是这些未分化的细胞创造了一个适于细胞存活的环境,使这个微环境具有有利于病变组织细胞存活的神经营养因子和/或神经生长因子,从而增强神经发生和促进病变组织神经细胞自身修复的进程。本研究采用PC12细胞株模拟神经细胞,以TNF-α刺激PC12细胞模拟神经系统病变发生凋亡的神经细胞,以转移筛网方法模拟共育体系培养PC12和BMSCs,研究共育微环境中BMSCs能否为TNF-α刺激PC12细胞提供保护作用,减少PC12细胞凋亡,促进PC12细胞自身修复;共育微环境中BMSCs是否通过分泌细胞因子或神经营养因子来提供保护、促进受损PC12细胞修复;以及BMSCs分泌细胞因子或神经营养因子的量是否与其所处的细胞微环境有关。
  材料与方法:
  一、BMSCs培养及鉴定
  二、实验模型
  1、PC12细胞凋亡模型
  以不同浓度(6.25、12.5、25、50、100、200、400 ng/ml)的TNF-α溶液作用于PC12。
  2、共育微环境模型
  以转移筛网方法将PC12和BMSCs共育培养。
  三、BMSCs对TNF-α损伤PC12的保护作用
  1、实验分组
  (1)阴性对照组:正常培养的PC12细胞。
  (2)阳性对照组:TNF-α处理PC12细胞2h后,弃去TNF-α,加入新鲜无血清培养基,培养24h。
  (3)共育培养组:将PC12与BMSCs共育培养,同时加入TNF-α处理2h后,弃去TNF-α,加入新鲜无血清培养基,培养24 h。
  (4)单向作用组:TNF-α处理BMSCs2 h后,弃去TNF-α,加入新鲜无血清培养基培养24 h,取该培养液上清培养TNF-α处理2h的PC12细胞24 h。
  (5)双向作用组:以TNF-α处理PC12细胞2h后,弃去TNF-α,加入新鲜无血清培养基培养24 h,取该上清培养TNF-α处理2h的BMSCs24 h,取该培养液上清培养损伤PC12细胞24 h。
  2、指标检测
  (1) MTT法检测各组的PC12细胞凋亡率。
  (2)电镜观察各组PC12细胞处理后超微结构变化。
  (3) realtime-PCR法检测PC12细胞表面TNF-R1、TNF-R2 mRNA表达变化。
  (4) Western Blot法测定PC12细胞caspase-8蛋白表达情况。
  (5) ELISA法测定PC12细胞中NF-κB p65变化。
  四、PC12对BMSCs功能的影响
  1、实验分组
  (1)对照组:以无血清培养基培养正常的BMSCs细胞。
  (2) TNF-α组:50 ng/ml的TNF-α处理BMSCs细胞2h后,弃去TNF-α,加入无血清培养基培养。
  (3)共育组:将PC12与BMSCs共育培养,同时加入TNF-α处理2h后,弃去TNF-α,加入新鲜无血清培养基。
  (4)条件培养液组:TNF-α处理PC12细胞2h后,弃去TNF-α,加入新鲜无血清培养基培养24 h,取该培养基上清培养BMSCs细胞。
  以上述各组作为平行对照。在同等条件下,先向BMSCs中加入NF-κB、JNK和ERK的抑制剂作用3h,再进行各组的相应处理。
  2、指标检测
  ELISA法检测不同条件培养的BMSCs培养液上清中GDNF、VEGF的含量。
  五、统计学处理
  所有数据采用SPSS13.0进行分析,多组间计量资料比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
  结果:
  一、BMSCs鉴定结果
  BMSCs表现为梭型及类成纤维细胞样,细胞形态均一。通过免疫荧光检测显示,BMSCs表面抗原CD45表达为阴性,说明非造血干细胞;CD44表达为阳性,说明为间充质干细胞类。
  二、不同浓度TNF-α对PC12细胞的影响
  细胞凋亡率随着TNF-α剂量增加而增加,并呈剂量-效应关系。其中50 ng/ml剂量时细胞存活率为53.40%,细胞凋亡率为40.74%。
  三、BMSCs对TNF-α损伤PC12的保护作用
  1、凋亡检测
  共育培养组、单向作用组、双向作用组PC12细胞存活率与阳性对照组相比明显提高,凋亡率下降。单向作用组、双向作用组PC12细胞存活率低于共育培养组,其中单向作用组差异较明显(P<0.05);双向作用组细胞凋亡率高于共育培养组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。双向作用组的细胞存活率高于单向作用组,但凋亡率低于单向作用组,差异有统计学意义(P<0.05)。
  2、电镜观察
  正常PC12细胞呈圆形,细胞膜表面微绒毛丰富,胞浆内见粗面内质网,线粒体及糖原颗粒,细胞核巨大,核切迹明显,有两个以上的核仁,细胞核以常染色质为主。阳性对照组:细胞膜内陷,细胞质空泡化,细胞核形状不规则,染色质浓集、边集化。共育培养组:受损细胞呈圆形,细胞膜微绒毛数量减少,胞浆内细胞器减少,但形态正常,可见线粒体数量明显减少,可见大量脂滴。核浆比例变小,有一个核仁,以常染色质为主。单向作用组:细胞膜微绒毛明显减少,核切迹明显,染色质浓缩。双向作用组:细胞呈椭圆形,细胞膜微绒毛减少,核内染色质有凝聚凝集现象,部分边集于核膜下。
  3、Realtime-PCR结果
  阳性对照组和单向作用组的TNFR1 mRNA表达明显上调,共育培养组和双向作用组变化并不显著;TNFR2 mRNA表达变化最大的为共育培养组和双向作用组,而阳性对照组及单向作用组变化并不明显。
  4、Western blot结果
  阳性对照组和单向作用组Caspase-8的裂解产物p26蛋白表达量较其余组明显上调,其中阳性对照组的procaspase-8表达量亦有明显增加(P<0.05)。共育培养组和双向作用组PC12 procaspase-8及其裂解产物p26蛋白表达均低于阳性对照组(P<0.05)。
  5、ELISA结果
  与阴性对照组比较,NF-κB p65在阳性对照组中浓度略有升高(P>0.05),而共育培养组、单向作用组和双向作用组NF-κB p65浓度则明显升高(P<0.05)。共育培养组和双向作用组NF-κB p65浓度与单向作用组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
  四、PC12对BMSCs功能的影响
  随着培养时间延长,对照组BMSCs在最初24 h分泌因子的量最高,之后则逐渐减少(P<0.05)。其他组BMSCs分泌2种因子的量均高于对照组。共育组BMSCs各时段分泌2种细胞因子的量最高,不同时点测定的GDNF分别为(200.54±45.98)、(115.19±24.61)、(98.60±15.01)pg/ml;不同时点测定的VEGF分别为(919.26±98.63)、(581.54±68.54)、(560.53±79.57)pg/ml。与对照组相比,共育组0~24 h、24~72 h、72~168 h分泌的GDNF、VEGF均有提高,且差异具有显著性(P<0.05)。
  对照组BMSCs在加入NF-κB抑制剂后各时间段分泌GDNF、VEGF量与未加入时无明显差异,TNF-α组、共育组、条件培养液组的BMSCs在加入NF-κB抑制剂后各时间段分泌GDNF、VEGF量与各自未加入的相应时间段相比均有所下降,尤其是在24~72 h和72~168 h时段BMSCs分泌GDNF、VEGF的量明显低于相应未加入抑制剂的平行对照(P<0.01)。
  结论:
  本研究将细胞分为共育培养组、单向作用组、双向作用组,共育培养组为两种细胞同时接受TNF-α的处理后共同培养;单向作用组为以TNF-α处理后的BMSCs培养液上清培养损伤的PC12细胞;双向作用组则以TNF-α处理的PC12细胞培养液上清培养BMSCs后,再用该上清反作用于损伤PC12细胞,目的是为了证实PC12细胞在受到损伤后能否在共育体系中发挥作用,最终利于自身的修复。通过细胞存活率和细胞凋亡率可以观察到,共育培养组细胞存活率较阳性对照组明显提高,凋亡率明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05),说明在共育体系中,BMSCs能够通过非接触方式抑制PC12细胞凋亡,提高PC12细胞存活率,促进PC12细胞修复。
  本实验中,阳性对照组PC12细胞TNFR1表达增加,并且产量最高,Caspase-8表达增加,说明PC12细胞通过TNFR1-TRADD-FADD途径诱导凋亡。另外,TNFR1还可以通过TNFR1-TRADD-TRAF途径激活NF-κB,进而抑制细胞凋亡和促进炎症反应;TNFR2也可以与TRAF结合形成复合体激活NF-κB,诱导基因转录,促进细胞存活、增殖和分化。但是在阳性对照组中,NF-κB尽管也呈阳性表达,但是其抑制凋亡的作用远不如活化的Caspase-8诱导凋亡作用明显。共育培养组和双向作用组PC12细胞TNFR1 mRNA表达较阴性对照组略有升高,Caspase-8表达高于阴性对照组,低于阳性对照组,说明共育培养组和双向作用组PC12细胞在BMSCs的干预下,TNFR1表达、Caspase-8表达均有所下降,而TNFR2与NF-κB的表达增加,这也是共育培养组和双向作用组凋亡率明显降低的原因。另外,共育培养组和双向作用组PC12细胞TNFR2表达提高,NF-κB活性增强,推测可能是由于BMSCs通过向培养液上清中释放具有保护作用的细胞因子,从而激活NF-κB,抑制TNFR1招募Caspase-8,抑制了PC12细胞凋亡,提高了PC12细胞的存活率,促进了PC12细胞的自身修复。故本实验证实了关于BMSCs治疗机制中的“细胞伙伴”观点,即移植的干细胞能够起到治疗作用,其为已发生凋亡或处于前凋亡状态的PC12细胞提供了一个适于存活/修复的环境,使这个微环境具有有利于PC12细胞存活的神经营养因子和(或)神经生长因子,从而抑制PC12细胞的凋亡、促进其自身修复的进程。
  BMSCs在正常培养情况下即可分泌GDNF、VEGF等细胞因子。BMSCs在受到TNF-α刺激后,细胞因子、神经营养因子等的分泌量提高,但是分泌速度随着培养时间的延长而降低。现阶段对于BMSCs功能的研究仍无法阐述神经系统中的损伤微环境诱导BMSCs释放这些生长因子的机制。本研究采用TNF-α模拟神经系统中的损伤因素作用于BMSCs,其损伤机制为:TNF-α与TNFR1结合后,可诱导TRADD、RIP、TRAF2形成复合物,并最终激活NF-κB信号通路以及包括p38、ERK、JNK的MAPK通路,进而影响细胞的增殖、凋亡、分化过程。在此凋亡通路中,NF-κB具有重要调节作用。NF-κB可以通过调控多种凋亡相关基因的表达引起神经细胞的损伤和保护。NF-κB通路在干细胞的增殖、迁移和分化中亦起重要作用。本实验中,在加入NF-κB抑制剂(PDTC)后,GDNF、VEGF2种因子的分泌量大幅下降,而加入ERK抑制剂与JNK抑制剂后,GDNF、VEGF2种因子的量无明显变化,说明BMSCs在50 ng/ml的TNF-α的刺激下,经由NF-κB途径释放GDNF、VEGF;释放GDNF、VEGF的机制与ERK、JNK途径无关,由此推测该机制应与p38 MAPK途径有重要关系。
  共育组BMSCs功能较对照组和TNF-α组均有明显提高;损伤PC12细胞条件培养液可以提高GDNF、VEGF的分泌量,但提高幅度不如共育组明显。此结果提示,损伤的PC12细胞可能通过向培养液上清中释放某些因子,这些因子与TNF-α作用相似,同样能够依赖NF-κB途径,而非JNK或ERK途径上调BMSCs分泌GDNF、VEGF的功能。
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作者: 李莉
学科专业: 神经内科;神经病学
授予学位: 博士
学位授予单位: 中国医科大学
导师姓名: 张朝东
学位年度: 2014
语 种: chi
分类号: R741.02
在线出版日期: 2014年10月31日