川芎嗪诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化及机制研究
神经退行性疾病和神经元损伤是神经系统常见病。此类疾病的预后与神经细胞的存活、神经元分化和功能恢复密切相关,亦与相关基因表达的激活或抑制有关。拓扑异构酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ,TopoⅡβ)是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是从伞形科藁本属植物川芎中分离提纯的一种活性生物碱,化学名2,3,5,6-四甲基吡嗪。最近有研究报道了其对神经干细胞向神经元分化有促进作用,但其确切作用机制尚不明了。本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型,用TMP诱导其向神经元分化,并检测细胞分化过程中TopoⅡβ的表达...
神经退行性疾病和神经元损伤是神经系统常见病。此类疾病的预后与神经细胞的存活、神经元分化和功能恢复密切相关,亦与相关基因表达的激活或抑制有关。拓扑异构酶Ⅱβ(TopoisomeraseⅡβ,TopoⅡβ)是促进神经发育和神经元分化的关键蛋白质。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是从伞形科藁本属植物川芎中分离提纯的一种活性生物碱,化学名2,3,5,6-四甲基吡嗪。最近有研究报道了其对神经干细胞向神经元分化有促进作用,但其确切作用机制尚不明了。本研究以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞为神经元分化模型,用TMP诱导其向神经元分化,并检测细胞分化过程中TopoⅡβ的表达变化;进而探讨TMP诱导神经元分化的分子机制。为TMP在神经系统疾病相关研究与治疗中的应用提供依据。本研究共分三部分。
  第一部分 川芎嗪对SH-SY5Y细胞生长特性的影响和神经元分化的诱导作用
  目的:研究TMP对SH-SY5Y细胞生长状况的影响,以及诱导其向神经元分化的作用。
  方法:1、细胞培养。2、MTT法检测SH-SY5Y细胞体外增殖活性,绘制细胞生长曲线。3、乳酸脱氢酶释放实验。4、细胞周期和凋亡率检测。5、细胞核DAPI染色。6、Caspase-3活性检测。7、细胞分化形态观察和分化百分率检测。8、免疫印迹检测神经元分化标志蛋白MAP2、tau的表达和p21蛋白的表达。
  结果:1.随着TMP浓度的增高和培养时间的延长,其对细胞增殖的抑制逐渐增加。提示TMP对SH-SY5Y细胞增殖的抑制作用具有浓度和时间依赖性。
  2.低浓度TMP(40,80和120μmol/L)对SH-SY5Y细胞无明显细胞毒性。
  3.TMP处理后,Caspase-3活性和active-Caspase-3蛋白表达无明显变化(P>0.05)。显示80μmol/L TMP在诱导SH-SY5Y细胞神经元分化中未导致细胞凋亡。
  4.在20μmol/L TMP作用下,SH-SY5Y细胞突起长度和分化百分率改变不明显(P>0.05)。而40μmol/L诱导2天,细胞突起开始出现明显增长,与对照细胞比较有显著性差异(P<0.05)。80μmol/L和120μmol/L TMP诱导SH-SY5Y细胞后,细胞神经突起长度和分化百分率均较对照细胞明显增长,且均比40μmol/L诱导后突起长度增加明显(P<0.05)。
  5.采用神经元分化标志分子,微管相关蛋白2和tau蛋白鉴定神经元分化。SH-SY5Y细胞经80μmol/LTMP诱导0,3和5日后MAP2和tau蛋白表达增高,与对照组细胞相比有明显差异(P<0.05)。
  结论:80μmol/L TMP诱导可使SH-SY5Y细胞脱离细胞周期,并向神经元分化;且未见明显的细胞毒性。因此,本研究选用80μmol/L TMP诱导神经元分化,并继续用于后继机制研究。
  第二部分 川芎嗪上调TopoⅡβ诱导SH-SY5Y细胞分化的表观遗传学机制
  目的:检测TMP诱导SH-SY5Y细胞分化过程中,TopoⅡβ的表达变化及其表观遗传学机制。
  方法:1、细胞培养。2、细胞分化形态观察和分化百分率检测。3、Western blot检测TopoⅡα、TopoⅡβ、组蛋白H3、H4、乙酰化组蛋白H3和乙酰化组蛋白H4的表达。4、逆转录PCR(RT-PCR)检测TopoⅡβmRNA表达。5、染色质免疫沉淀技术检测Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因启动子区的募集与结合。
  结果:1.与对照细胞比较,TMP诱导分化细胞的TopoⅡα蛋白表达在第3天和第5天均明显减少(P<0.05);而TopoⅡβ蛋白表达则明显增加(P<0.05)。
  2.与对照细胞相比,TopoⅡβmRNA的表达在TMP诱导分化的第3天和第5天均表现为增加(P<0.05)。
  3.TopoⅡβ抑制剂ICRF-193作用后,TopoⅡβ和MAP2蛋白表达受到抑制(P<0.05);神经突起数量和长度均明显下降(P<0.05)。表明TopoⅡβ与神经元分化呈正相关。
  4.Ac-H3的表达在TMP诱导分化的第3天和第5天逐渐增加(P<0.05);而Ac-H4的表达在TMP诱导分化的第5天明显增加(P<0.05)。提示Ac-H3与Ac-H4均可被TMP诱导表达,而Ac-H3表达升高相对较早。
  5.ChIP检测显示,TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,随着诱导分化时间的延长,特异性结合在TopoⅡβ基因启动子区的Ac-H3与Ac-H4逐渐增高(P<0.05)。Ac-H3在TopoⅡβ基因启动子区的结合早于Ac-H4。提示Ac-H3发挥作用早于Ac-H4。
  结论:TMP诱导神经元分化作用与TopoⅡβ表达的上调有关。TMP促进Ac-H3和Ac-H4在TopoⅡβ基因启动子区的募集而诱导TopoⅡβ高表达,是促进神经元分化的重要机制。
  第三部分 PI3K/Akt信号通路参与川芎嗪诱导SH-SY5Y细胞神经元分化
  目的:探讨TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,PI3K/Akt和ERK1/2信号通路对TopoⅡβ表达和神经元分化的影响及机制。
  方法:1、细胞培养。2、细胞分化形态观察和分化百分率检测。3、Western blot检测蛋白质表达。4、RT-PCR检测TopoⅡα和TopoⅡβmRNA表达。5、ChIP检测转录因子Sp1与NF-YA在TopoⅡβ基因启动子区的结合。
  结果:1.TMP对p-Akt、p-ERK1/2、TopoⅡα、TopoⅡβ、Sp1和NF-YA蛋白表达的影响
  80μmol/L TMP诱导SH-SY5Y细胞分化0,1,3和5天。TopoⅡα蛋白的表达逐渐减少,TopoⅡβ蛋白表达逐渐增多;p-Akt的表达逐渐升高(P<0.05),p-ERK1/2表达无明显变化(P>0.05);Sp1的表达逐渐增高(P<0.05),而NF-YA蛋白表达无明显变化(P>0.05)。
  2.PI3K/Akt抑制剂LY294002对p-Akt,TopoⅡα、β、Sp1和NF-YA蛋白表达的影响
  应用LY294002后,80μmol/L TMP诱导细胞分化5天,TopoⅡα蛋白的表达减少,且不受LY294002的影响;TopoⅡβ和Sp1蛋白表达和p-Akt的表达受到明显抑制(P<0.05)。p-ERK1/2和NF-YA蛋白的表达无明显变化(P>0.05)。
  3.LY294002抑制TMP诱导的神经突起的发生和神经元分化标志蛋白的表达
  TMP诱导第5天,应用LY294002后,TMP诱导细胞的突起长度由150.97±6.62μm下降为91.80±7.82μm(P<0.05),细胞分化百分率由80.04±3.26%下降为46.20±33.56%(P<0.05)。而MEK/ERK抑制剂U0126对细胞形态、细胞突起长度和分化百分率均未产生明显作用(P>0.05)。经LY294002处理细胞后,神经元分化标志蛋白MAP2的表达受到明显抑制(P<0.05)。而U0126对MAP2蛋白表达未产生明显抑制作用。表明PI3K/Akt信号通路参与了TMP诱导的SH-SY5Y细胞分化。
  4.LY294002对TMP诱导TopoⅡα和TopoⅡβmRNA表达的影响
  TMP可上调TopoⅡβmRNA的表达,而抑制TopoⅡαmRNA的表达。与TMP诱导组相比较,加入PI3K/Akt抑制剂LY294002作用后,TopoⅡβ mRNA的表达下调(P<0.05),而TopoⅡαmRNA的表达无明显改变(P>0.05)。分别应用蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮(Cycloheximide,CHX)和RNA聚合酶Ⅱ抑制剂鹅膏菌素(α-amanitin)预处理SH-SY5Y细胞后检测TopoⅡβ mRNA的表达,结果显示:α-amanitin(50μg/mL)可明显降低TMP诱导的TopoⅡβmRNA的表达,而CHX(10 mmol/L)则对其表达无明显影响。表明TMP上调TopoⅡβ的表达发生在转录水平,并且与PI3K/Akt信号途径的激活有关。
  5.TMP诱导转录因子Sp1和NF-YA在TopoⅡβ基因启动子区结合
  ChIP检测显示,TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化过程中,Sp1蛋白特异性结合在TopoⅡβ基因启动子GC盒,促进了TopoⅡβ的转录表达。而加入PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002作用后,结合在TopoⅡβ基因启动子区的Sp1蛋白受到明显抑制(P<0.05)。转录因子NF-Y的亚型NF-YA在神经分化后期与TopoⅡβ基因启动子区的结合也呈现增高(P<0.05),而LY294002对NF-YA与TopoⅡβ基因启动子区的结合没有明显影响(P>0.05)。结果提示PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信号途径参与了TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。
  结论:TMP诱导神经元分化过程中,PI3K/Akt信号被激活;转录因子Sp1受到PI3K/Akt通路的调控;Sp1与TopoⅡβ基因启动子区结合,促进TopoⅡβ基因的转录激活。PI3K/Akt/Sp1/TopoⅡβ信号途径参与了TMP诱导SH-SY5Y细胞向神经元分化。
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作者: 闫永鑫
学科专业: 细胞生物学
授予学位: 博士
学位授予单位: 河北医科大学
导师姓名: 闫蕴力
学位年度: 2015
语 种: chi
分类号: R741 R285.5
在线出版日期: 2015年9月7日