干细胞诱导分化为神经细胞的研究
目的:研究干细胞向神经细胞分化不仅可以应用于临床,为神经系统疾病,如帕金森症、脑卒中、脊髓病变患者进行细胞移植,使其尽快康复;还可以作为研究哺乳动物神经系统发育的体外模型,了解神经分化过程中基因表达调控的变化,并方便进行基因操作。 既往认为神经细胞是终末分化细胞,其损伤后很难再由神经干细胞补充。因此,中枢神经系统神经元损伤不能再生,尤其哺乳类动物神经元缺乏再生能力。 从上世纪80年代开始,有研究表明移植外周神经和胎髓能促进脊髓损伤轴突的再生。以后,诸多实验显示了脊髓损伤后可能会再生。最近,有研究表明中枢神经系统神...
目的:研究干细胞向神经细胞分化不仅可以应用于临床,为神经系统疾病,如帕金森症、脑卒中、脊髓病变患者进行细胞移植,使其尽快康复;还可以作为研究哺乳动物神经系统发育的体外模型,了解神经分化过程中基因表达调控的变化,并方便进行基因操作。 既往认为神经细胞是终末分化细胞,其损伤后很难再由神经干细胞补充。因此,中枢神经系统神经元损伤不能再生,尤其哺乳类动物神经元缺乏再生能力。 从上世纪80年代开始,有研究表明移植外周神经和胎髓能促进脊髓损伤轴突的再生。以后,诸多实验显示了脊髓损伤后可能会再生。最近,有研究表明中枢神经系统神经元损伤可由神经干细胞来补充。而且,其它来源的干细胞,如:骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)和胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)在一定条件下均可分化为神经元样细胞。但是,诱导分化的比例还很低。 将大鼠MSCs移植到脊髓挫裂伤的大鼠体内,显示了明显的功能恢复。研究者直接地或将大鼠MSCs与神经球细胞共培养后,通过局部注射的方式移植进大鼠损伤脊髓内,发现实验组大鼠的后肢运动功能比对照组明显恢复,形态学检测显示移植的MSCs位于损伤区中心,且朝向损伤中心牵拉宿主组织,阻止脊髓空洞的形成。虽然诸多研究表明MSCs可部分修复损伤脊髓的解剖连接,但目前仍无充分证据证明MSCs能够恢复损伤脊髓的神经传导功能。 本实验拟摸索出一种简便有效、无毒性的体外大比例诱导干细胞分化为神经细胞的方法,并通过移植干细胞研究其体内向神经细胞分化。并进一步通过基因芯片分析证实诱导结果,筛选向神经细胞分化的主导基因,研究干细胞向神经细胞诱导分化的机理。 方法: 1.MSCs的分离培养、鉴定和向神经细胞诱导分化 1.1在无菌条件下取Wistar大鼠股骨和胫骨骨髓细胞做原代培养。 1.2根据细胞贴壁性能不同,筛选易贴壁但贴壁不牢的细胞进行传代培养。 1.3免疫细胞化学染色法鉴定MSCsCD45和CD90的表达情况。 1.4向神经细胞诱导分化:β-巯基乙醇+DMSO+降低血清浓度 1.5免疫细胞化学染色法检测NSE。 2.ESCs培养、鉴定和向神经细胞诱导分化 2.1钙钴法碱性磷酸酶染色鉴定未分化ESCs。 2.2免疫荧光法检测神经细胞特异性抗原Nestin、NSE、NCAM1、NF-L和GFAP。 2.3ESCs(鼠ES细胞系AB2.1由南加州大学医学院惠赠)按常规培养于饲养层细胞上。诱导分化时去饲养层细胞,重新接种于无包被的培养皿中,使用神经干细胞培养液,逐渐更换为无血清神经干细胞培养液。 3.MSCs体内诱导分化为神经细胞 3.1BrdU(5’-溴脱氧尿苷)体外标记MSCs。 3.2MSCs移植。 3.2.1制备大鼠脊髓左侧半横断损伤模型。 3.2.2实验组12只:术后立即向损伤区远端注射MSCs,对照组12只:注射等量磷酸缓冲盐溶液。 3.3移植后鉴定。 3.3.1采用BBB评分系统评估大鼠行为学改变。 3.3.2心脏灌流固定大鼠脊髓组织。 3.3.3免疫组织化学染色法观察BrdU标记的MSCs在脊髓损伤处存活情况。 3.3.4取材前48小时行辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪。 3.3.5HRP示踪结果观察脊髓损伤处神经通路的重构建。 3.3.6皮层体感诱发电位(CSEP)测定脊髓损伤处神经通路传导功能的恢复。 4.表达基因芯片分析采用AffymetrixMOE430A小鼠表达谱芯片进行未分化及分化后第4、10天细胞基因表达谱差异的分析。 5.半定量RT-PCR在mRNA水平检测ESCs、神经干细胞及神经细胞相关基因。 6.诱导分化前后细胞端粒酶活性检测(TRAP)。 7.统计学分析。 结果: 一、MSCs分离培养和向神经细胞诱导分化1.MSCs免疫细胞化学法检测CD45完全阴性,CD9070%阳性。2.MSCs在预诱导和更换为无血清培养液后产生似神经细胞,细胞80%表达NSE。 二、MSCs体内向神经细胞诱导分化 1.术后实验组大鼠后肢运动功能比对照组恢复明显,1周、2周、3周、4周,8周BBB评分均高于对照组。 2.术后1周行石蜡切片,免疫组织化学染色显示在实验组大鼠脊髓损伤区远端检测到BrdU阳性细胞。 3.术后2个月行冰冻切片,在实验组大鼠的损伤脊髓近侧端的腹侧角检测到HRP阳性细胞,而于对照组大鼠未检测到HRP阳性细胞。 4.术后2个月行CSEP测定,实验组大鼠的CSEP波形恢复但波幅减低,潜时期延长,对照组大鼠未见CSEP引出。 三、ESCs体外诱导分化为神经细胞未分化的ESCs聚集成团状生长,细胞排列紧密,集落边界清楚,碱性磷酸酶染色呈强阳性,胞浆布满棕黑色颗粒。使用序贯诱导法可将ESCs大比例诱导分化为神经样细胞,光镜下观察细胞形态均一、胞体圆亮、突起细长。分化细胞表达多种神经细胞标志物,免疫荧光法示NSE、NCAM1阳性率>80%,GFAP<1%。 四、ESCs体外诱导分化为神经细胞机理研究 基因芯片检测诱导后第10天细胞Nestin、Sox2、Cdk5、Dnmt3A、NSE、NF-M、NCAM1、MAP2等神经特异性基因均有高表达,且有GABA受体、谷氨酸脱羧酶(GAD)表达,其他神经递质受体及其合成酶等未见表达,说明诱导后细胞大多为GABA能神经元。胶质细胞标志基因GFAP、MBP未检测到,其他胚层的标志性基因也没有表达。半定量RT-PCB亦证实上述结果。 未分化ESCs端粒酶活性最强,随分化天数增加,端粒酶活性逐渐下降,至第10天,端粒酶活性已经很弱,但仍强于PMEF-P3。 结论: 1.应用beta-巯基乙醇和无血清培养液诱导MSCs分化为神经细胞可达到80%的分化率。 2.局部注射MSCs移植进脊髓损伤区,MSCs可在损伤区存活并分化为神经元,在损伤局部形成神经元通路,使损伤脊髓的远端和近端建立联系,从而使脊髓神经纤维传导功能恢复。 3.通过我们实验摸索出的“序贯诱导法”可以将ESCs大比例诱导成为高纯度神经元。 4.通过基因芯片分析,有望从大规模基因表达谱中筛选神经元分化相关及特异性基因。
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作者: 庞希宁
学科专业: 细胞生物学
授予学位: 博士
学位授予单位: 中国医科大学
导师姓名: 于秉治
学位年度: 2005
语 种: chi
分类号: R322.81
在线出版日期: 2006年6月13日