大鼠胰岛和胰腺干细胞的体外分离和培养
成体胰腺内存在着具有繁殖分化能力的干细胞。由于成体胰腺内的β细胞属分化终末细胞,自我复制能力极低,多数学者认为,成体胰腺内衰老、死亡的β细胞主要是由具有潜在分化能力的胰腺干细胞增殖、分化来补充。并且,在胰腺导管部分结扎的动物模型中,观察到有胰岛细胞的再生现象。近年来,由于无血清组织细胞培养技术的发展及对胰腺干细胞认识的提高,已成功的在体外培养条件下分离培养出具有繁殖和分化能力的胰腺干细胞,但目前对胰腺干细胞的了解甚少,还没有从单一细胞克隆出胰岛,而且,由胰腺干细胞培养出的β细胞其分泌胰岛素能力很低,还不能够满足临床上...
成体胰腺内存在着具有繁殖分化能力的干细胞。由于成体胰腺内的β细胞属分化终末细胞,自我复制能力极低,多数学者认为,成体胰腺内衰老、死亡的β细胞主要是由具有潜在分化能力的胰腺干细胞增殖、分化来补充。并且,在胰腺导管部分结扎的动物模型中,观察到有胰岛细胞的再生现象。近年来,由于无血清组织细胞培养技术的发展及对胰腺干细胞认识的提高,已成功的在体外培养条件下分离培养出具有繁殖和分化能力的胰腺干细胞,但目前对胰腺干细胞的了解甚少,还没有从单一细胞克隆出胰岛,而且,由胰腺干细胞培养出的β细胞其分泌胰岛素能力很低,还不能够满足临床上移植的需要。本研究应用组织细胞体外培养技术,从大鼠胰腺非胰岛细胞中体外分离、培养出nestin阳性细胞,并使其形成胰岛样细胞团,表达胰岛素,证明其具有干细胞特点。 第一部分:SD新生大鼠和成熟大鼠胰岛分离。 SD新生大鼠胰岛分离应用我们独创的完整胰腺胶原酶消化法。原始的新生鼠胰岛分离采用组织剪碎后经胶原酶消化法,该方法不可避免的损伤部分胰岛,使胰岛的形态和功能受损。由于新生鼠胰腺内纤维组织较少,胰腺体积小,胰腺的各部分可以较均匀的暴露在胶原酶中,本研究经过多次试验发现,新生鼠胰腺在1mg/ml的新配制的胶原酶中,37℃消化14min可以完全消化胰腺组织,并可获得形态功能良好的胰岛,简化了胰岛分离步骤,减少了污染机会,有利于进一步培养。成熟大鼠胰岛分离应用胰管内胶原酶灌注法消化胰腺,首先结扎胆总管末端,于胆总管内注入胶原酶,使整个胰腺充分扩张,取出胰腺,放入胶原酶中静止消化16min,应用含5%血清的Hank's液中终止消化,吸管反复吹打,可以使胰岛与外分泌腺分离,可获得形态和功能良好的胰岛。该方法易于控制消化时间,组织消化均匀,对胰岛损伤小,获得的胰岛经DTZ染色可见胰岛形态良好,对葡萄糖刺激下胰岛素释放试验反应良好。 第二部分:胰腺干细胞的体外培养 将消化好的胰腺组织放入含10%胎牛血清的PH7.6RPMI1640液(1%双抗)中37℃、5%CO2培养箱中培养。24h可见有细胞贴壁生长,但胰岛不贴壁,改用PH7.4RPMI1640无血清培养,添加bFGF、EGF各20ng/ml、1%N2添加剂,当贴壁细胞达培养板5%时,弃去上清液和胰岛,每24h换液一次,可见贴壁细胞快速增长,4-7d形成单层细胞,并渐集聚成细胞团,18-22d形成胰岛样细胞团,添加nicotinamide后可见胰岛样细胞团明显增多,留取不同糖浓度培养的上清液,应用[3]Ⅰ放射免疫法可检测到胰岛素,加用nicotinamide后,葡萄糖刺激下胰岛素释放能力增强。形成的胰岛样细胞团用移液管吹打脱落后传代培养仍可形成单层细胞,并可反复传代,具有极强的繁殖能力。本研究中发现,新生鼠胰腺消化物培养的单层细胞具有较强的形成胰岛样细胞团能力,但成熟大鼠形成的胰岛样细胞团少,功能也低于新生鼠形成的胰岛样细胞团。 本实验培养出的胰岛样细胞团与Ramiya和Bonner-Weir等报道的IPSCs、CHIBs相似,都具有自我复制和分化的能力,表现出干细胞特点。IPSCs、CHIBs来源于导管上皮细胞,而Zulewski等报道的NIPc来源于胰岛内,同样具有胰腺干细胞特点。本研究中胰岛样细胞团倾向来源于非胰岛细胞。实验早期胰岛不贴壁,而且贴壁细胞不表达胰岛素,形成胰岛样细胞团后,添加nicotinamide可有胰岛素的表达,说明贴壁细胞分化为β细胞。 为此本研究对早期贴壁细胞进行进一步鉴定。 第三部分:胰腺干细胞鉴别 应用免疫荧光细胞化学方法对早期贴壁细胞进行CK19、Insulin、Glucagon、Nestin检测,结果发现,培养36h的贴壁细胞大多为Nestin阳性细胞,而不表达CK19、Insulin、Glucagon。培养中期及形成的胰岛样细胞团传代后仍可有Nestin的表达,但Nestin的表达不一,说明细胞处于不同的分化状态。胰岛样细胞团传代后可有Insulin、Glucagon的表达,说明Nestin阳性细胞具有分化为内分泌细胞的能力,并可反复传代具有干细胞特点。 早期贴壁细胞中提取总RNA,行RT-PCR检测CK19、Nestin,参考已发表的文献设计引物,进行CK19、Nestin扩增。其中Nestin扩增后蛋白电泳获得500左右碱基对的片段,测得序列长为523bp,与genebank对照证实为大鼠Nestin片段,而CK19扩增后未获得相应片段,说明形成胰岛样细胞团的贴壁细胞来源于Nestin阳性细胞而非CK19阳性细胞。 CK19、Nestin被认为是胰岛干细胞的表面标记。本实验培养出的胰岛样细胞团来源于Nestin阳性细胞,但不同于Zulewski等报道的来源于胰岛内的Nestin阳性细胞。尽管不能完全排除分离过程中破碎胰岛内的Nestin阳性细胞贴壁生长,但本实验培养出的Nestin阳性细胞倾向来源于导管内,因为培养早期无胰岛帖壁生长,而且分离的胰岛大多形态良好,并且,经免疫荧光细胞化学方法检测无β细胞贴壁生长。 本实验证实了胰腺内Nestin阳性细胞具有胰腺干细胞特点,为胰腺干细胞的体外分离培养提供了新的途径,但如何使成体内体外分离出的胰腺干细胞进一步成熟,尚有许多工作要做。一旦胰腺干细胞分化为β细胞的数量和分泌胰岛素的能力达到临床移植需要,就能为糖尿病治疗提供一种更有效、更简捷的方法。 综上所述,本研究在新生鼠胰岛分离过程中,首创了完整胰腺胶原酶消化法,并在体外培养条件下成功地从大鼠胰腺非胰岛细胞中培养出Nestin阳性细胞,在无血清培养条件下使其快速增长,形成胰岛样细胞团,并可传代培养,经nicotinamide培养后可分化为表达胰岛素的β细胞,证实胰腺内Nestin阳性细胞具有胰腺干细胞特点。
展开
作者: 田井琦
学科专业: 外科(普外科)
授予学位: 博士
学位授予单位: 吉林大学
导师姓名: 张德恒
学位年度: 2004
语 种: chi
分类号: R329.24