生物技术法处理废弃几丁质和制备几丁寡糖的研究
成果信息
项目年度编号: 1200160082
限制使用: 国内
省市: 浙江
中图分类号: X714
成果类别: 应用技术
成果公布年份: 2010
关键词: 废弃几丁质处理 几丁寡糖 饲料添加剂 养殖资源开发利用
成果简介: 1、绿色木霉内切几丁质酶基因克隆和序列分析:通过PCR、RT-PCR手段钓取了绿色木霉内切几丁质酶基因DNA及cDNA,通过一系列分子克隆手段,获得了含有内切几丁质酶基因及全长cDNA序列的载体并对其序列特性进行分析。利用各种软件对绿色木霉内切几丁质酶测序结果经过分析,预测了其蛋白质的一级结构、二级结构、亲/疏水性,模拟三级结构的三维模型,为进一步研究该蛋白的高级结构、活性中心位点以及PCR定点突变奠定基础。2、绿色木霉内切几丁质酶在大肠杆菌中的表达研究:构建了含内切几丁质酶的原核表达载体pET28a-ECH和pET28a-MECH,并转化到宿主菌BL21(DE3)中,获得了含有内切几丁质酶重组大肠杆菌。结合SDS-PAGE电泳技术对这两株重组菌产生的蛋白大小进行对比,研究了绿色木霉内切几丁质酶自身的信号肽在大肠杆菌表达时是否被切除。用DNS法测定了重组内切几丁质酶酶活,确定了重组大肠杆菌表达的内切几丁质酶的活力,比较了pET28a-MECH转化BL21重组菌和pET28a-ECH转化BL21重组菌的产酶活力。3、重组大肠杆菌高效表达内切几丁质酶的培养条件的研究及酶学性质研究:对影响重组内切几丁质酶高效表达的几个主要因素如诱导剂添加时间、诱导剂添加量、装液量及接种量等进行了研究。在最佳培养条件下进行诱导表达,并对重组内切几丁质酶的性质进行了研究,如最适反应温度、最适反应pH值、酶的稳定性及金属离子和底物浓度对酶活的影响。4、绿色木霉内切几丁质酶真核表达载体的构建:从含有内切几丁质酶基因的重组大肠杆菌中扩增出内切几丁质酶基因ECH。分别用限制性内切酶EcoRI、NotI对载体pPIC9K和ECH基因进行双酶切并用T4-DNA连接酶连接,构建了含内切几丁质酶基因的真核表达载体pPIC9K-ECH,并将其转化到大肠杆菌DH5α中。对其进行PCR、双酶切鉴定及测序分析。5、绿色木霉内切几丁质酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达研究:用线性化酶Bpu1102I对pPIC9K-ECH进行线性化处理后,电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,并用不同浓度的G418进行高拷贝子的筛选,结合酶活测定方法筛选高产内切几丁质酶的工程菌株,结合SDS-PAGE、PAGE电泳技术及酶谱分析外源内切几丁质酶的蛋白大小。6、重组巴斯德毕赤酵母摇瓶发酵生产内切几丁质酶的研究:考察了甲醇、油酸、表面活性剂、微量元素、pH值、菌体浓度、装液量及诱导时间对重组内切几丁质酶表达量的影响。在此基础上通过Plackett-Burman实验设计确定了影响重组酵母表达内切几丁质酶的关键因素,并选取了三个重要因素进行响应面实验设计。获得一份发酵生产内切几丁质酶的最佳诱导培养基配方,为以后的高密度发酵培养奠定基础。7、重组内切几丁质酶的分离纯化:收集发酵培养液,用PEG20000浓缩、DEAEsepharoseFF初步分离纯化重组内切几丁质酶。8、几丁寡糖的制备:利用重组内切几丁质酶催化粉末几丁质生成几丁寡糖的最优化工艺流程和工艺参数。内切几丁质酶毕赤酵母工程菌能够降解昆虫及某些真菌的细胞壁,可制成活菌制剂,是一种良好的生物农药,在植物抗真菌和抗病虫害方面具有较好的应用前景。几丁寡糖具有重要的生理功能:(1)几丁寡糖具有清爽的甜味,有吸湿和保湿性,其在水中溶解度比单糖低,有助于调整食品的水活性,增进保水性,兼具调味和改良食品质构的功能,另外几丁寡糖可促进肠道内有益菌(Bifidus)的增殖并抑制大肠杆菌及肠道内病原菌的生长,是一种良好的双歧杆菌增殖因子;(2)在农业方面几丁寡糖可用作饲料添加剂,提高动物免疫力,在植物中具有防治植物病虫害、促进植物生长的功能,几丁寡糖能够启动植物防御系统,使其本身处于不易受侵害的生态环境中,同时该寡聚糖具有抗菌、抑菌效果,用该类寡糖做的肥料不利于土壤中病菌和细菌的生长;(3)在医药工业中,几丁质经酶作用后所产生的寡糖具有抗癌作用,活化机体免疫功能,诱使胰脏淋巴T细胞产生Interleukin,且对生物体无毒性或低毒性;(4)在化妆品中利用该寡聚糖良好的保湿性可作为保湿乳液、化妆水的原材料,该产品效果与hyaluronicacid类似,但成本降低近一半。该产品还可用于发胶中,能保护头发,赋予光泽,具有紫外吸收性,可防止头发受到紫外光的破坏,几丁寡糖研制开发国外走在前列,国内五十年代初才开始进行研究,直到八十年代后才受到重视。该省海洋资源丰富,淡水养殖业发展也相当迅速,因而几丁质资源非常富裕。虽然有一些从事几丁质开发利用的生产厂家,但产品仅限于生产几丁质及壳聚糖,作为化工及医药等原料出口,环境污染大、附加值低;而几丁寡糖具有区别于单糖的许多重要的生理功能,是一种具有广泛应用的产品,附加值高,市场紧缺。该项目的研究既能有效利用几丁质资源,解决几丁质所导致的环境污染问题,又能生产高附加值的产品几丁寡糖,对于防止资源浪费、增加经济效益和劳动力就业、提高环境保护等具有重要的意义,因此经济、社会和生态效益较好,市场及应用前景广阔。
申报信息
登记号: 09022008
登记日期: 20091028
工作起止时间: 20060400-20090600
相关人信息
完成单位: 浙江工商大学
完成人: 于平 励建荣 汤绯 陈敏 傅玲琳 陆海霞 张蕾 陈卫 唐云平 章慧慧
行业及专利信息
应用行业名称: 非金属废料和碎屑的加工处理 其他食品制造
应用行业码: 432 149
转让信息
投资信息
推广信息
联系信息
联系单位名称: 浙江工商大学
联系单位地址: 浙江省杭州市下沙高教园区学正街18号
传真: (0571)28877222
邮政编码: 310018