耐温耐酸α-淀粉酶高产菌株的选育及其淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达研究
成果信息
项目年度编号: 1700450782
限制使用: 国内
省市: 广西
中图分类号: TQ925.1
成果类别: 应用技术
成果公布年份: 2017
关键词: 淀粉酶 枯草芽孢杆菌 基因表达
成果简介: 课题的来源与背景:课题来源:该课题来源于广西自然基金课题“耐温耐酸α-淀粉酶高产菌株的选育及其淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达研究(2010GXNSFD013030)”。课题背景:α-淀粉酶能从淀粉分子的内部任意切开α-1,4糖苷键,产生分子量较小的麦芽糊精、葡萄糖及其它低聚糖,在淀粉糖加工业、纺织工业、造纸工业、制药行业、酿酒行业及燃料乙醇生产中被广泛应用,具有相当大的商业价值。市售的淀粉酶最适pH为6.0-7.0,糖化酶的最适pH为4.5左右,两者的作用pH值差异较大,而淀粉原料液的天然pH为4.5-5.0左右。传统工艺淀粉液化后需添加酸来降低pH值后糖化酶才起作用,这样用酸碱反复调节原料液的pH,既增加工艺,又引入外源离子,加重了分离的负担,需要开发适合该生产条件的酸性α-淀粉酶。技术原理及性能指标:技术原理:该课题是从自然界、宏基因组获得多样性的α-淀粉酶,探讨以定向进化、分子设计及两者结合的方法,从非理性和理性两个方面着手对酶进行分子改造,重点解决温度、pH适应性。在非理性方面,利用易错PCR以及DNA shuffling等体外分子进化技术对酶进行定向进化;在理性设计方面,分析酶的三维空间结构,利用能量分析软件对酶中各个氨基酸的能量进行分析,预测对酶活性有重要影响的位点。性能指标:建立一套筛选丁二酸高产菌株的非定向改造及筛选方法,获得具有自主知识产权的丁二酸高产菌株2株以上;获得的突变株关键限速酶酶活明显提高,副产物含量降低20%以上,探索琥珀酸放线杆菌体内进行基因克隆、表达及基因敲除等基因工程技术的条件,为进一步进行定向改造打下基础;过对获得突变菌株菌株进行发酵条件优化,使丁二酸产量达60g/L以上;发表相关学术论文3篇,其中以第一作者发表国内核心论文1篇,其他课题组成员发表2篇,申请相关国家发明专利1项;培养硕士生1名。技术的创造性与先进性:通过该项目的研究工作,课题组在耐酸淀粉酶的改造技术有了较大的提高,掌握了淀粉酶的改造技术,总结出根据蛋白质的pka值和其三维结构B-FACTOR因子来对酶进行理性设计突变的方法并在实验中进行了验证。在酶的结构和功能关系、优良酶以及具有自主知识产权的编码这些酶类的基因的研究取得了较好的进展,建立了比较完善的酶分子改造技术平台。获得的耐酸耐热的α-淀粉酶,其作用温度分别为65℃、75℃,pH由6.0降到5.5,在pH4.0-7.0范围内酶活力保持在80%以上。将改造获得的突变酶基因连接枯草芽孢杆菌表达载体,构建重组表达质粒后导入蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌中进行表达成功。在该基础上总结出了根据蛋白质的pka值和其三维结构B-FACTOR因子来对酶进行理性设计突变的方法。该项目共发表研究论文8篇,其中6篇国内核心期刊,2篇SCI。申请并获得授权专利1项,培养方面,培养博士1名,硕士2名。有淀粉酶的研究主要集中在菌株筛选及发酵条件优化方面,而通过理性及非理性改造的研究国内较少报道。因此该项目处于国内领先水平。技术的成熟程度,适用范围和安全性:该项目的研究成果还处于实验室小试阶段,主要应用于淀粉质原料发酵产乙醇,无安全问题。应用情况及存在的问题:主要存在近几年石油价格持续走低,已及淀粉质原料成本持续走高,导致生物质能源产品无法与石油基产品竞争,随着石油价格上涨,淀粉质燃料乙醇会强势复苏,该项目产品将具有良好的经济效益和社会效益。历年获奖情况:该项目尚未获得相关奖项。
申报信息
推荐部门: 广西科学院
登记号: 201711228
登记日期: 20170508
相关人信息
完成单位: 广西科学院
完成人: 王青艳 廖思明 王成华 申乃坤 秦艳 谢能中 朱婧 朱绮霞 杜其石 金辉
行业及专利信息
应用行业名称: 生物、生化制品的制造
应用行业码: 276
转让信息
投资信息
推广信息
联系信息
联系单位名称: 广西科学院
联系单位地址: 广西壮族自治区南宁市大岭路98号
邮政编码: 530003