罗汉果葡萄糖基转移酶的全长克隆及原核表达研究
成果信息
项目年度编号: 1700451172
限制使用: 国内
省市: 广西
中图分类号: TQ925
成果类别: 应用技术
成果公布年份: 2017
关键词: 罗汉果 葡萄糖基转移酶 基因表达
成果简介: 课题的来源及背景:项目是由桂财教[2013]19号文件下达的广西自然科学基金项目“罗汉果葡萄糖基转移酶的全长克隆及原核表达研究”,合同编号为2013GXNSFBA019170。由广西壮族自治区药用植物园承担。研究的目的和意义:该项目拟在完成罗汉果转录组及表达谱的Solexa高通量测序的基础上,找到与罗汉果甜苷V代谢极显著相关的葡萄糖基转移酶基因(UDPG)的unigene片段,通过RACE技术对这5条最显著相关的UDPG基因进行全长克隆。再设计引物,利用实时荧光定量PCR技术研究该UDPG在罗汉果不同生育时期、不同组织部位的时空表达规律。最后,通过构建UDPG原核表达载体,经IPTG诱导产生重组蛋白,纯化其重组蛋白,辅以罗汉果醇、甜苷II或III为底物,通过HPLC或LC-MS技术验证其催化产物,从而找到催化甜苷V生物合成的特异或专一的葡萄糖基转移酶,为实现皂苷生物合成关键酶UDPG的同源或异源表达,大幅提高罗汉果甜苷V的产量奠定理论基础,可为后期基因工程育种和基因调控提供理论依据和基因资源,同时,对于有效提高罗汉果及其提取物的商品价值、做大做强广西道地药材罗汉果产业具有重大的意义。主要论点及论据:葡萄糖基转移酶在罗汉果皂苷生物合成中起到重要的催化作用,以苷元-罗汉果醇为起点,可能存在不同的UDPG参与甜苷V的生物合成,其中罗汉果醇C-3位、C-24位加上不同的葡萄糖基,最终形成不同的罗汉果苷,通过功能验证及时空表达规律分析,候选的SgUDPG1和SgUDPG4可能参与了罗汉果苷的生物合成代谢,SgUDPG1可能主要在果实发育早期参与低糖苷合成代谢,SgUDPG4可能主要在果实发育中后期参与高糖苷合成代谢,其它UDPG可能参与了罗汉果黄酮类成分的生物合成。通过qRT-PCR分析候选基因Actin、18S rRNA、Ubiquilin、efl-α、efl-β和Tubulin在其中的表达特性,18S rRNA基因在所有样品中表达量高且表达最稳定,是罗汉果基因表达qRT-PCR分析适宜的内参基因。创见与创新:采用基于第二代高通量测序技术对罗汉果的转录组和表达谱进行测序,结合含量分析,筛选罗汉果三萜皂苷合成关键酶-葡萄糖基转移酶的重点候选基因;采用RACE技术对罗汉果葡萄糖基转移酶进行全长基因克隆;采用实时荧光定量PCR技术筛选罗汉果稳定表达的看家基因,研究葡萄糖基转移酶在罗汉果不同时期及部位中的时空表达规律;对候选的罗汉果葡萄糖基转移酶通过原核表达及蛋白催化,验证其基因功能。社会经济效益及存在问题:社会经济效益:项目为应用基础研究,暂不产生直接的经济效益,但该项目的研究成果为实现皂苷生物合成关键酶UDPG的同源或异源表达,大幅提高罗汉果甜苷V的产量奠定理论基础,可为后期基因工程育种和基因调控提供理论依据和基因资源,同时,对于有效提高罗汉果及其提取物的商品价值、做大做强广西道地药材罗汉果产业具有重大的意义。存在的问题:该项目克隆了7个葡萄糖基转移酶基因全长,筛选出罗汉果稳定表达的看家基因18S rRNA基因,分析了其时空表达规律,构建了原核表达载体和真核表达载体,诱导获得目的基因可溶性重组蛋白进行了基因功能鉴定体外实验,推测出SgUDPG1可能参与罗汉果甜苷早期合成代谢,SgUDPG4可能参与罗汉果甜苷中后期合成代谢,达到了预期研究目标。但是,由于葡萄糖基转移酶底物、位置专一性强,以及罗汉果苷同分异构体多、单体物质缺乏,因此进行这些葡萄糖基转移酶生化特性鉴定工作量较大,通过体外筛选实验尚未鉴定出这些基因的功能。历年获奖情况:2014年11月,该研究内容作为《罗汉果遗传育种与良种推广》的一部分,获得了中华中医药学会科学技术奖二等奖(证书号:201402-07 ZY-31-R-07)。成果简介罗:汉果是中国独有的药用和甜料植物,为广西道地药材。甜苷V具有很好的药理药效,应用前景广阔。但甜苷V含量低、生产成本高的问题严重制约着产业的发展。传统种植时间长、效率低,从分子水平阐明甜苷V生物合成途径,找到控制甜苷V合成的关键酶基因,利用基因工程或发酵工程实现转基因超表达或高效生物转化,是提高甜苷V含量快速而有效的新途径,UDPG作为甜苷V生物合成中最后一步关键酶而成为研究重点。根据UDPG的催化机制和罗汉果苷的结构特点,课题组推测可能存在多种UDPG参与罗汉果醇向甜苷V的生物转化,催化罗汉果醇C-3位和C-24位加上不同数量的葡萄糖基,寻找特异催化甜苷V的UDPG是实现其基因调控的关键所在。在完成罗汉果转录组及表达谱的Solexa高通量测序的基础上,该项目克隆了7个罗汉果葡萄糖基转移酶基因全长,筛选出罗汉果稳定表达的看家基因18S rRNA基因,分析了其中5个基因(SgUDPG1、SgUDPG2、SgUDPG4、SgUDPG6和SgUDPG7)时空表达规律,并构建这5个基因的原核表达载体5个和真核表达载体3个,诱导获得目的基因可溶性重组蛋白进行了基因功能鉴定体外实验,推测SgUDPG1可能参与罗汉果甜苷早期合成代谢,SgUDPG4可能参与罗汉果甜苷中后期合成代谢,在该基础上,能有望发现特异催化甜苷V合成的葡萄糖基转移酶,对于后期提高甜苷V含量、降低甜苷V生产成本具有重大的生产价值。项目的各项研究成果均为国内首创,既具有很高的理论水平,又具备实际推广应用价值。通过项目的研究,公开发表核心期刊论文7篇。
申报信息
推荐部门: 广西壮族自治区卫生和计划生育委员会
登记号: 201711831
登记日期: 20170621
相关人信息
完成单位: 广西壮族自治区药用植物园
完成人: 唐其 潘丽梅 韦荣昌 唐春风 赵欢 邢爱佳
行业及专利信息
应用行业名称: 生物、生化制品的制造
应用行业码: 276
转让信息
投资信息
推广信息
联系信息
联系单位名称: 广西壮族自治区药用植物园
联系单位地址: 广西壮族自治区南宁市长堽路189号
传真: (0771)5637328
邮政编码: 530023