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M基因缺失型狂犬病病毒载体在新型动物疫苗研制及病毒中和抗体检测中的应用研究
M基因缺失型狂犬病病毒载体在新型动物疫苗研制及病毒中和抗体检测中的应用研究
| 成果信息 |
| 项目年度编号： |
2400121503 |
| 限制使用： |
国内 |
| 省市： |
广东 |
| 中图分类号： |
S859.79 |
| 成果类别： |
基础研究 |
| 成果公布年份： |
2024 |
| 关键词： |
狂犬病
动物疫苗
抗体检测方法
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| 成果简介： |
1.课题来源与背景：该成果的课题来源为广东省科技计划项目"M基因缺失型狂犬病病毒载体在新型动物疫苗研制及病毒中和抗体检测中的应用研究"(项目编号：2014A020214006)。在中国预防和控制狂犬病的关键是建立完善的动物狂犬病预防体系，通过疫苗接种包括宠物犬、流浪犬在内的各种犬类及野生动物，从源头上控制狂犬病。预防体系的建立依赖于疫苗免疫的规划、实施和效果评价，而对动物抗体水平的监测是评价疫苗免疫效果的重要依据。传统的狂犬病灭活疫苗安全、有效，但成本昂贵。弱毒疫苗成本低廉，但存在毒力残留或致病性回复突变的安全隐患。因此，中国依然亟需研制一种经济、安全、有效的狂犬病疫苗。世界上预防狂犬病最广泛使用的是灭活的狂犬病疫苗。这类疫苗尽管有效，但需要接种多针才能诱导足够的免疫保护，一般保护期为半年到1年，而且价格昂贵。减毒活疫苗仅需极少量病毒就能有效诱导保护性免疫应答，这类疫苗的生产成本通常比灭活疫苗显著降低，而且可能通过非注射的方式进行接种，如口服接种等。但是，现有的减毒活疫苗(主要限用于野生动物)都不同程度地存在安全性方面的问题。狂犬病病毒反向遗传操作系统近年来已成功应用在新一代狂犬病疫苗的多项研究中。利用该技术开发出更安全、更有效、更廉价的狂犬病减毒活疫苗及新型的病毒中和抗体监测手段，对于全世界特别是发展中国家的狂犬病预防非常必要。
世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(OIE)认可的狂犬病病毒中和抗体检测方法主要是快速荧光灶抑制实验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)。这两种方法在检测结果的一致性和稳定性方面都比较好。但这两种方法依然存在一些缺陷，它们都要以狂犬病病毒标准固定毒株CVS-11为实验毒株进行血清抗体的中和试验，该毒株为致病株，存在安全风险。同时两种方法的操作复杂，对实验室条件和操作人员的要求较高，且需要价格昂贵的荧光素标记的抗体作为实验材料。因此，它们不适用于一般实验室或基层用于狂犬病病毒中和抗体水平的监测，现今仍亟需研发建立一种安全、经济且快速的狂犬病病毒中和抗体检测方法。已有一些研究利用表达绿色荧光蛋白的重组狂犬病病毒建立病毒中和抗体的检测方法，但这些方法都存在一个问题是，所用重组毒株都来源于弱毒毒株，这些毒株在病毒表面的糖蛋白序列上具有一定的差异，糖蛋白是狂犬病病毒重要的抗原性蛋白，因此使用弱毒株所测得的中和抗体水平是否能真实地反映中和野毒株或强毒株的抗体水平？这个问题尚需进一步探讨。另一方面，虽然这些方法使用的是弱毒株，但依然存在潜在的病毒扩散风险。
2.技术原理：该成果在基因缺失型病毒的基础上，整合入绿色荧光蛋白EGFP基因，在表达强毒的G基因的BHK细胞上拯救出表达EGFP的重组狂犬病病毒，利用此重组病毒建立起了一种准确、快速、安全的狂犬病病毒中和抗体检测方法。在疫苗研究方面，同时开展2条技术路线的研究。路线一是将华南地区犬细小病毒流行毒株的主要抗原基因VP2插入狂犬病病毒基因组，研究该重组病毒的生物学特性、安全性及免疫原性，为研制出经济、安全、有效的狂犬病和犬细小病毒病的基因工程二联疫苗株奠定基础。路线二是将具有良好免疫佐剂活性的IL-6基因插入含双G基因的狂犬病病毒基因组中，构建出一种能够快速、低剂量诱导机体产生保护的基因工程疫苗。该研究在保证安全性的同时，拓宽了狂犬病病毒载体的运用范围，也为研制具有自主知识产权的犬类传染病防控产品打下坚实的基础。
3.技术的创造性与先进性：
(1)利用G基因缺陷型重组毒株建立了一种安全、经济的狂犬病病毒中和抗体检测方法，该方法能够解决标准或已有方法中存在的几个不足：一是该重组毒株能表达绿色荧光蛋白，做完中和试验后即可直接在荧光显微镜下观察，无需固定细胞及利用荧光素标记的抗体进行检测，既经济也能节省时间；二是该重组毒株可以在表达狂犬病病毒CVS-11毒株糖蛋白的BHK-21细胞中繁殖，并在出芽释放时获得细胞表达的CVS-11毒株糖蛋白，CVS-11为RFFIT和FAVN两种标准方法所用的固定毒株。因此，利用该重组毒株建立的狂犬病病毒中和抗体检测方法在准确性上优于利用弱毒株建立的检测方法；三是该重组毒株的基因组中缺失糖蛋白基因，因此无法在普通细胞和动物体中复制和扩散，是一种复制缺陷型毒株，具有很高的安全性。
(2)构建和拯救了一种携带2个G基因和广州地区犬细小病毒流行毒株VP2基因的重组狂犬病病毒。该重组病毒相较于亲本株具有较高的培养滴度，可以降低犬用疫苗的生产成本，又能够在小鼠体内诱导产生较高的抗狂犬病病毒抗体与抗犬细小病毒抗体水平，可以作为狂犬病和犬细小病的二联疫苗候选株。
(3)携带和表达犬源IL-6基因的重组狂犬病病毒rHEP-CaIL6能够迅速激活小鼠中枢神经系统的干扰素通路及相关细胞因子，强烈诱导机体的体液免疫和细胞免疫反应，产生较高的狂犬病病毒中和抗体水平，免疫较低的剂量即可起到90%以上的攻毒保护率。研究结果表明，IL-6可以起到良好的免疫佐剂效果，rHEP-CaIL6有望成为一种具有较大潜力的犬用基因工程疫苗。 |
| 申报信息 |
| 鉴定部门： |
广东省科学技术厅 |
| 鉴定日期： |
2021-11-10 00:00:00 |
| 登记号： |
粤科成登（1）字[2022]A0126号 |
| 登记日期： |
2022-02-15 00:00:00 |
| 计划名称： |
广东省科技计划 |
| 工作起止时间： |
20150301-20190228 |
| 相关人信息 |
| 完成单位： |
华南农业大学 |
| 完成人： |
罗永文 郭霄峰 琚春梅 郭慧霞 田钦 张戴婷 张宝石 |
| 行业及专利信息 |
| 应用行业名称： |
兽用药品制造 |
| 应用行业码： |
275 |
| 转让信息 |
| 投资信息 |
| 推广信息 |
| 联系信息 |
| 联系单位名称： |
华南农业大学 |
| 联系单位地址： |
广东省广州市天河区五山路483号 |
| 邮政编码： |
510642 |
