| 成果简介： |
1.研究背景及意义：杧果（Mangifera indica L.）原产于热带，是深受大众喜爱的一种水果，中国是仅次于印度的世界第二大杧果生产国，广西是中国最大的杧果生产基地，杧果产业已经成为广西重要农业产业，种植杧果是许多当地农民主要的收入来源。右江河谷以其得天独厚的气候资源使广西百色成为全国的杧果优势产业带，是中国著名的“杧果之乡”，百色杧果也获得农业部“农产品地理标志登记认证”。杧果产业的发展，不仅为中国水果产业的良好发展做出了较大的贡献，而且对提高果农收入、促进地方经济发展也起到极为重要的作用。
杧果虽然相对于广西种植的其他果树来说其抗旱性较强，但是由于中国可利用的耕地资源有限，特别是广西处于石山地区，果树的种植条件较为恶劣，大部分杧果种植于缺乏灌溉条件且地势较陡的山地和旱坡地上，整个生育期所需的水只能依靠自然降水来供应。杧果在不同生育阶段都有可能受到干旱的影响，干旱常常威胁着杧果的正常生长及发育，严重制约了杧果产业的稳定发展。虽然近年来政府大力扶持杧果产业，建设了不少灌溉设施，但依然远远满足不了整个杧果产业链抵御干旱的需求。选育抗旱性强的杧果品种是保证杧果产业可持续发展的重要举措。在常规的杂交育种方法因其耗时长且某些优良性状不易观察的情况下，基因工程技术的兴起和不断发展为杧果的抗逆育种提供了新的有效手段，可以有针对性地遗传改良杧果的各种性状，同时也能加快育种的进程。通过挖掘并筛选杧果的抗旱基因，研究它们的抗旱功能，可为有效利用这些基因提供良好的研究基础。针对广西杧果产区经常发生的干旱对杧果产业造成的严重后果，以培育高产、优质、抗旱性强的杧果新品种为核心内容，充分挖掘并利用杧果的抗旱基因，研究杧果抗旱的分子机制，对开展杧果的分子育种和抗旱种质资源的创新进程意义重大。
2.研究结论：
（1）项目结合前期的相关研究基础，通过查阅相关文献，选定目标基因，运用RACE技术从“台农一号”杧果中克隆了MibZIP4646和MiWRKY75两个基因。生物信息学分析表明：MibZIP4646基因全长1317bp，共编码438个氨基酸，其编码的蛋白质分子量为47.32kDa，等电点为9.69；WRKY75基因全长525 bp，为完整的开放阅读框，共编码174个氨基酸，其编码的蛋白质分子量为21.12kDa，等电点为9.23，属于碱性蛋白，两个基因均无明显疏水区，不含跨膜结构和信号肽；蛋白的二级结构分析表明，MibZIP4646蛋白含有134个α-螺旋、8个β-转角、248个无规则卷曲和48个延伸链，分别占30.59%、1.83%、56.62%和10.96%。MiWRKY75二级结构中，该蛋白含有30个α-螺旋、10个β-转角、103个无规则卷曲和31个延伸链，分别占17.24%、5.74%、59.20%和17.82%。系统进化树分析表明，两个基因均与同样是是漆树科的阿月浑子的亲缘关系最为接近，同源性最高，与甜橙的同源性次之，都属于各自基因家族的成员。
（2）构建了两个基因的原核表达载体，经0.2mM IPTG诱导，目的蛋白均以包涵体的形式表达，经超声波破碎后用镍柱进行纯化，获得高纯度（90%）的目的蛋白，均成功进行了Western blotting鉴定；以pSuper1300-GFP和目的基因构建了融合表达载体，利用农杆菌介导瞬时表达体系在烟草叶片上进行进行蛋白的亚细胞定位，发现融合的目的蛋白在烟草叶片细胞中均定位于细胞核，与前期软件预测的结果一致。
（3）实时荧光定量PCR分析表明，MibZIP46和MiWRKY75在杧果的根、茎、叶中均能表达，但在各组织中的表达量有显著差异。MibZIP46基因主要在杧果的茎和叶中表达；MiWRKY75基因则是呈现了完全不同的结果，其主要在根中表达。200mM NaCl、15% PEG和0.1mM ABA的胁迫处理均能诱导两个基因的表达，但MibZIP46基因能被ABA在短期内强烈诱导，MiWRKY75基因相对来说对外源ABA并没有MibZIP46那么敏感。
（4）构建了MiWRKY75基因的植物表达载体并进行遗传转化烟草的研究，经PCR检测后，对四个转基因株系做抗旱性分析，发现在干旱胁迫下，转基因株系表现出明显优于野生型对照的生长及表型特征，进一步分析分析其叶片相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量和SOD酶活性均显著高于对照。转基因株系的抗旱表现显著优于对照，综合分析发现T1、T3株系的抗旱性表现最好。
该研究的结论可为挖掘并利用杧果的抗旱基因，研究杧果抗旱的分子机制，对开展杧果的分子育种和抗旱种质资源的创新进程提供相关的理论依据。
3.研究展望：
（1）调控植物抗逆性的基因网络时十分复杂的，该研究中仅仅研究了两个基因，还不足以深入揭示其调控机制，后续可对杧果进行干旱胁迫的转录组测序，分析抗旱基因所参与的相关代谢通路及与其他基因的互作，进一步揭示其调控机制。
（2）转基因烟草各株系后代需进行遗传稳定性分析并评估其抗旱性能，为进一步利用其在其他植物上进行遗传改良提供参考。 |
