订阅最新相关文献

1.抗生素滥用问题在中国畜禽养殖业中日趋严重，耐药性、药物残留以及环境污染问题正在挑战国人的健康底线。为促进养猪业快速达到国家农业农村部对抗生素减量化标准的要求，加快养猪业绿色减抗养殖的快速稳步发展，同时助力该省中药资源产业脱贫攻坚及乡村振兴的步伐，该项目拟在猪场中开展中兽药减少抗生素使用量的相关研究和推广应用，将该课题组自主研发的“紫菀百部颗粒”和“健脾散”等中兽药产品，根据猪生长发育中主要疾病的发病规律科学应用于猪养殖体系中，主要针对猪生长周期中主要疾病开展降低养殖端抗生素使用量的研究，逐步由示范基地向周边猪场辐射并大力推广应用；加强科技示范场的培育力度，为养殖企业提供减抗养殖技术支撑，推动该省养猪业向高效、减抗、绿色、质优等方向发展。该项目的实施，不仅能够提升养猪产业中抗生素减量化使用的行业标准和技术水平，更有助于该省中药产业链开发利用和畜禽减抗绿色养殖共同发展。 2.由于猪支原体性肺炎(Mycoplasma Pneumonia of Swine)仍没有理想的疫苗用于预防该病，利用抗菌药物防治是当前国内外采取的主要措施。通过人工诱发猪喘气病模型，将自主研发的紫菀百部颗粒用于该病并研究其治疗效果。结果表明，紫菀百部颗粒对气喘病患病猪只疗效显著，能明显减轻病猪的临床症状。从试验结果看，紫菀百部颗粒低、中、高剂量组对猪喘气病均具有一定的效果，显效率、治愈率都有提高。此外，对猪喘气病模型猪的增重结果显示，紫菀百部颗粒的增重效果随着剂量的增加而增加，中、高剂量组与模型组相比较差异极显著(P<0.01)，与阳性药物组相比差异不显著(P>0.05)。表明中兽药紫菀百部颗粒对猪气喘病具有良好的保护作用，可用于猪喘气病的临床应用。 3.研发出具有益气固表功效的中兽药健脾散，能够通过缓解断奶仔猪的免疫力低下，增强消化吸收功能有效预防仔猪的断奶应激综合征。将优化后的健脾方添加到断奶仔猪的基础日粮中，不仅能够提高断奶仔猪的免疫能力与生长性能，也可以提高断奶仔猪血清中免疫球蛋白水平，以及猪瘟、猪伪狂犬抗体效价，降低血液与肠道中促炎因子水平，从而提升断奶仔猪的免疫能力。此外，健脾散还能够提高断奶仔猪的消化吸收能力，具体体现在断奶仔猪肠道紧密连接蛋白与肠道营养物质转运载体表达水平升高，肠道抗氧化能力增强，此外，背腰最长肌中慢速肌纤维蛋白表达也显著升高。 4.在甘肃、四川省的十余家养殖单位共计5万头生猪养殖中，推广应用紫菀百部颗粒，对猪的呼吸系统疾病治疗效果显著，降低猪呼吸道疾病的发病率达30-60%以上，减少抗生素使用量为20-30%以上；健脾散是针对早期断奶仔猪，具有健脾益气的功效，在断奶仔猪日粮中添加后，可显著提高断奶仔猪的生长性能，增加免疫力和抗病能力，促进仔猪肠道健康，减少仔泻率达60%以上，提高仔猪存活率，降低抗生素使用量。

1.课题来源与背景：根据市委组织部《关于开展2022年省级人才项目申报推荐工作的通知》要求，市动物卫生监督所立足当前肉牛产业中牛支原体肺炎多发、常发态势，围绕流行病学调查、临床诊断、病原检测、免疫预防等方面，组织申报了张掖市牛支原体肺炎综合防控技术研究及技能人才培养项目，通过市委组织部推荐，成功入选2022年度陇原青年创新创业人才(团队)项目名单，并下达项目资金20万元。通过该项目的实施，计划达成如下目标任务：一是应用流行病学调查方法，对该市肉牛养殖重点乡镇牛支原体肺炎进行全面普查，查清发病重点区域、危害程度，为精准防控牛支原体肺炎提供科学依据；二是对发病牛进行现场观察和病理剖检，掌握发病规律、发病季节、发病年龄及典型临床症状、病理变化，为该病的临床诊断提供参考；三是应用兽医实验室检测方法(分子生物学方法)，对采集的病样进行病原检测，查清该病病原，为该病的确诊和免疫预防奠定基础；四是在查清疫病发生流行、掌握诊断方法的基础上，通过采取免疫预防、对症治疗、消毒灭源和无害化处理等综合防控措施，有效控制牛支原体肺炎的发生和流行，为张掖市肉牛产业健康可持续发展创造有利条件。在牛支原体肺炎综合防控技术研究推广的同时，带动培养一批基层实用技能人才。 2.技术原理及性能指标：应用流行病学调查方法，对甘州、临泽、高台三县区13个肉牛养殖重点乡镇79个养殖场(小区)的牛支原体肺炎疫病进行调查，查清了发病重点区域、发病规律和危害程度。对病死牛进行现场观察和病理剖检，分离出8株牛支原体病原，选择15种药敏纸片对分离出的病原开展药敏试验，拟定了药物治疗方案，开展了药物治疗试验。引进华中农业大学研制的牛支原体疫苗(中试产品)9000头份，在发病重点乡镇开展疫苗免疫试验，共免疫育肥牛、犊牛和怀孕母牛共880多头，开展免疫试验肉牛养殖场(小区)的发病率和病死率显著下降。根据该病的流行情况，结合项目取得的成功经验和做法，制定了《张掖市牛支原体肺炎综合防控技术规程》，并在肉牛养殖重点乡镇进行示范推广，重点发病乡镇(沙井镇、小满镇)牛支原体肺炎发病率降低8%以上、发病死亡率降低10%以上。围绕项目关键环节，在国家级核心期刊发表论文1篇、省级期刊发表论文2篇、制作科普短视频1个，2项国家发明专利处于发明公布阶段。邀请华中农业大学和兰州兽研所专家教授，累计开展现场指导服务38场次、座谈交流3场次，现场指导农牧民500多人次，培养专业技术人才41名，培养乡村兽医、养殖场技术骨干等农村实用技术人才200多人次。 3.技术创造性和先进性：一是应用流行病学方法，查明该市牛支原体肺炎的重点发病流行区域、危害及流行规律。二是通过临床检查和病理剖检，掌握典型临床症状和病理变化。三是采集病样，采用分子生物学方法查清病原。四是研究筛选适宜本地血清型的特异性疫苗，在生产中开展免疫预防。五是通过实验室药敏试验和临床试验筛选特效药物和合理组合配方在临床上进行治疗。六是将研究成果集成配套，制定“牛支原体肺炎综合防控技术规程”，在生产中进行普及、推广。 4.应用情况：通过应用牛支原体肺炎综合防控技术，重点发病乡镇沙井镇、小满镇牛支原体肺炎的发病率分别从11.2%和10.6%减低至1.62%和2.8%，病死率从17%和39.8%减低至5.1%和4.2%，以以上两个乡镇的饲养基数9782头和10460头计算，养殖损失减少626.92万元；推广到项目实施的3个县区13个乡镇，年肉牛养殖损失减少(暨养殖效益增加)2000多万元。

凉山州羊遗传资源丰富，拥有建昌黑山羊、美姑山羊等著名地方品种，肉羊产业是凉山州巩固脱贫攻坚成果衔接乡村振兴的重要依托，但凉山州肉羊养殖以传统养殖为主，规模化程度低，饲草料缺乏、繁殖效率不高、饲养管理水平低、疾病防治技术落后等问题突出，自2011年以来，项目完成相关单位从营养调控、繁殖机理、饲养管理和疾病防治等方面开展了大量研究，取得了如下主要成果： (一)深入探索了本地肉羊繁育分子机制，首次发现凉山黑绵羊存在多胎基因： 利用分子育种技术，解析了卵巢oar-miR-214_3p对凉山黑绵羊发情调控的作用机制，发现了羊发情周期不同生殖激素的变化规律，首次发现凉山黑绵羊存在多胎基因。获得了早期妊娠诊断LncRNA生物标志物，初步建立了高产羔率分子标记辅助选择的方法，形成了“多胎基因检测+同期发情+适时人工输精”快繁技术体系，使羊场繁殖率由80%-90%提高至120%-130%。 (二)集成了肉羊疫病防控技术，相关技术连续两年入选四川省农业主推技术。 集成了羊场环境控制与粪污治理技术，有效减少羊场废弃物约60%，降低肉羊发病率约15%，生产效率提高10-20%，该技术连续两年入选四川省农业主推技术。改进了疾病防疫的措施，研发了疾病预防血清分离器、养殖场清洁消毒器等一系列疾病诊断和预防的新设备，以及羊身固定器、羔羊投药装置等疾病治疗的新工具，提高了疾病防治效果。 (三)深入探索了饲草生产管理关键技术： 研发了秸秆型发酵饲料、水培饲料和中草药添加剂，在羊场推广应用后，肉羊生长速度提高约12.8%，疾病发生率降低约23.6%，解决了羊只冬春季节饲草缺乏和营养不均衡的问题。开发了肉羊生态养殖营养配方设计与智能投喂系统和智慧化牧草种植管理与产量预测系统，提高了当地肉羊配方设计和饲草生产管理水平。 (四)构建了凉山肉羊饲养管理配套技术体系： 对美姑山羊、建昌黑山羊等品种的生产性能及繁殖性状进行了全面测定和评估。针对当地养羊特点，设计研发了新型饲喂槽、牧场门径通道、通风换气装置、饲料混合装置等适用于凉山肉羊养殖的设施设备，有效改善了肉羊养殖环境，提高了饲养管理效率。构建了凉山肉羊饲养管理配套技术体系。 (五)学术、产业影响显著提高： 1、共获授权专利28件，其中发明专利2件；获软件著作权7项；发表论文23篇，其中SCI论文6篇；出版相关专著5部，1项技术连续2年入选四川省农业主推技术。 2、以现场培训、视频会议、资料发放等形式累计开展培训、技术指导上百次，培训指导农牧民1.2万人次，发放技术资料0.45万份。 (六)应用推广及效益： 2021年以来，该成果产生效益规模累计商品羊391.14万只、能繁母羊162.38万只，新增经济效益21.31亿元，其中近两年(2022-2024年)新增经济效益10.35亿元，带动就业1000余人，牧民户均实现增收3000元，在助农增收中发挥了重要作用，极大地推动了民族地区肉羊养殖业的发展。

中国是畜禽养殖大国，福建是养禽大省。随着产业发展、气候变化及RNA病毒的不断变异，使禽流感等动物疫病日趋复杂，严重威胁畜牧业和人类健康。该团队多年来从事流感病毒、白血病病毒两种重要RNA病毒的研究，聚焦在病毒感染与免疫调控的前沿科学问题，探讨持续变异的病毒与宿主之间复杂的互作关系，深入解析蛋白质和非编码RNA在病毒感染致病中的功能，阐释病毒致病与宿主免疫调控的分子机制，为疫病防控和保障公共卫生安全提供科学指导。取得以下重要创新性成果： 1、揭示了Syk、ZC3HAV1等重要宿主蛋白在抗病毒免疫应答中的作用及其机理。发现了宿主Syk激酶通过活化STAT1在抗流感病毒天然免疫应答中发挥关键调控作用，并阐明了作用机制；解析了锌指蛋白ZC3HAV1通过调控I型干扰素介导的抗病毒免疫应答来抑制流感病毒复制的机理；阐明了IFITMs、CH25H、PKR等分子在抵抗流感病毒入侵过程中的功能及作用机制。这些重要成果大大加深了对宿主抗流感病毒免疫应答分子调控网络的认识，成果在Cell子刊Cell Rep、国际免疫学重要期刊Front Immunol等上发表。 2、在国际上首次筛选、鉴定、命名了四种重要lncRNAs，解析了这些lncRNAs在病毒致病致癌和宿主天然免疫中的重要功能及作用机制。鉴定了一种受Abl癌基因调控的重要lncRNA，命名为lncRNA-IUR，阐明了lncRNA-IUR通过调控STAT5-CD71信号通路抑制白血病病毒或癌基因介导细胞癌变的分子机理；鉴定并命名了lncRNA IFITM4P，发现其作为竞争性内源RNA（ceRNA）调控流感病毒诱导的免疫应答；鉴定并命名了lncRNA ISR，发现其反馈性调控IFN-β表达从而抑制病毒复制的重要机制；鉴定并命名了lncRNA RDUR，揭示其影响RIG-I介导的信号通路参与病毒-宿主互作的新机制。成果在国际权威学术期刊Mol Cancer【影响因子（IF）为27.7】、国际病毒学权威期刊J Virol（并被该期刊选为亮点论文，配有专文评述与推荐）、Front Immunol等上发表。 3、阐明了流感等病毒通过自身蛋白或“劫持”宿主蛋白实现其感染致病的新机制。通过体内体外研究揭示了流感病毒通过劫持宿主蛋白SOCS3促进宿主产生“细胞因子风暴”进而导致肺组织损伤的分子机制；阐述了白血病病毒Tax和HBZ蛋白在抑制宿主抗病毒反应和逃避免疫监视中的调节功能；发现了流感病毒NS1蛋白维持自身稳定性、拮抗宿主免疫功能的新机制。成果发表在国际兽医学权威期刊Vet Res、及国内外重要期刊Front Immunol、Acta Pharmacol Sin等上。 上述研究获国家自然科学基金委的重点项目（联合基金）和重大研究计划培育项目等资助。主要成果发表SCI论文10篇，总他引次数711次，其中5篇代表作总他引201次。5篇代表作最新的总IF为51.80。

①课题来源与背景：脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)属于小RNA病毒科，心病毒属成员，它能引起动物和人类发生脑炎和心肌炎，还能引起多种哺乳动物发生神经系统疾病，是一种重要的人畜共患病的病原体。当前，随着该病毒的接连爆发已经对畜牧养殖业的发展酿成了巨大的经济损失，对世界公共卫生和人类健康产生了一定的威胁。 干扰素诱导的跨膜蛋白(Interferon induced Transmembrane proteins，IFITMs)是一种重要的宿主限制因子，其表达受干扰素调控。IFITMs具有广谱抗病毒作用，可抑制IAV、WNV、HIV、DENV、RSV、CSFV、ASFV等增殖。 该项目组近年来一直在从事EMCV的相关研究，前期利用酵母双杂交筛选与EMCV衣壳蛋白互作的蛋白时，发现IFITMs可以与EMCV的VP1和VP2蛋白互作，通过EMCV感染HEK293细胞后，qPCR分析检测发现IFITMs表达显著上调，过表达IFITM1和IFITM3感染EMCV后，发现IFITMs过表达组可以抑制EMCV增殖，表明IFITMs可以抑制EMCV增殖。 猜想EMCV感染宿主细胞后激活I型干扰素信号通路启动，促使IFNα/β表达，IFNα/β大量表达后激活JAK1信号通路，进而导致ISGs大量的转录和表达，而IFITMs是ISGs其中之一。那么，EMCV感染宿主细胞后IFITMs表达上调，是否和猜想的一致：启动了I型干扰素信号通路，进而激活JAK/STAT信号通路，导致IFITMs表达上调？IFITMs抑制病毒感染的途径和机制是什么？ ②研究目的与意义：探索IFITM蛋白在EMCV复制增殖过程中的作用，明确IFITMs激活I型干扰素信号通路的机制，为后续探明IFITMs的抗病毒作用机制奠定基础，并为抗病毒药物开发或作为IFN-β信号通路激活剂使用提供参考。 ③主要论点与论据：通过该项目研究，证实EMCV感染宿主细胞后IFITMs表达上调；同时启动了I型干扰素信号通路，进而激活JAK/STAT信号通路，发挥抗病毒的功能；此外IFITMs在病毒的进入过程发挥抑制作用。具体研究进展内容如下： (1)EMCV感染促进IFITMs：将HEK293细胞接种于六孔板，接种EMCV(0.001 MOI)，选取接种后不同时间段(6h、12h和24h)收集细胞，提取细胞总RNA及总蛋白应用RT-qPCR及免疫印迹检测IFITMs的表达，结果发现EMCV感染可明显促进IFITMs蛋白的表达。 (2)EMCV感染激活I型IFN信号通路：将HEK293细胞接种于六孔板，接种EMCV(0.001 MOI)，选取接种后不同时间段(6h、12h和24h)收集细胞，提取细胞总RNA及总蛋白应用RT-qPCR及免疫印迹检测RLR通路相关因子(MDA5、MAVS、TBK1和IRF3)以及IFNβmRNA表达情况，结果发现EMCV会激活IFNβ的表达以及相关因子的蛋白表达水平，提示EMCV感染会有效激活IFN信号通路。 (3)过表达IFITMs抑制EMCV的复制：在HEK293细胞中转染IFITMs表达质粒后，接种EMCV(0.001 MOI)，感染24h后收集细胞上清进行病毒粒子拷贝数检测以及病毒滴度测定测定，结果发现IFITMs蛋白对EMCV感染有明显的抑制作用。 (4)下调IFITMs蛋白表达促进EMCV增殖：由于IFITMs基因之间同源性较高，故设计靶向IFITMs基因的siRNA，转染HEK293细胞后进行EMCV感染实验，通过RT-qPCR和TCID50检测EMCV复制情况，结果发现下调IFITMs表达后有效促进EMCV的增殖。 (5)IFITMs对病毒吸附和进入等过程的影响：将HEK293细胞接种到6孔板中，转染IFITMs表达质粒24h后，分别用高剂量和低剂量(3 MOI和1 MOI)的EMCV感染细胞，感染后进行病毒的吸附(4℃，1h)和进入(37℃，1h)等实验，RT-qPCR分析病毒基因转录情况，提示IFITMs抑制EMCV进入过程，但对吸附过程无明显影响。 (6)IFITMs靶向MDA5激活I型IFN信号通路：将IFITMs表达质粒与通路相关因子MDA5、MAVS、TBK1和IRF3(5D)表达载体共转染HEK293细胞后，RT-qPCR检测IFN-β的表达水平，发现IFITMs有效激活MDA5介导的IFN-β表达，以此推断MDA5可能是IFITMs作用的靶分子。通过Co-IP实验进一步证实IFITMs与MDA5之间存在相互作用，干扰MDA5表达后，IFITM激活IFN-β的能力降低，进一步证实MDA5即为IFITMs作用的靶分子。 (7)IFITM有效激活IFN-β结构域的筛选：由于IFITM2蛋白激活IFN-β的能力以及抗病毒能力最强，故优先选择IFITM2进行其有效结果域的筛选。分别构建IFITM2 C端和N端的表达载体，转染HEK293细胞后进行EMCV感染实验，结果发现N端结构域激活IFN-β的能力强于C端，对病毒粒子拷贝数和病毒滴度的研究同样发现N端的抗病毒能力更强，以上结果说明IFITM2发挥抗病毒作用与其激活I型IFN信号通路的能力有关。 ④创见与创新： (1)该项目选择EMCV作为研究对象，EMCV既是重要的人兽共患病病原，也是RNA病毒模型代表，研究后形成的理论具有较好的代表性和参考价值。 (2)病毒和宿主是共存的，宿主不断的进化，病毒也在不断的进化，即协同又拮抗，该项目通过研究IFITMs对EMCV的抑制作用，为增强机体免疫能力，变被动为主动，为进一步在预防、治疗以及抗病毒应用等方面提供充分的理论依据。 (3)IFITM2通过靶向MDA5促进IFN-β的表达，表明IFITM2蛋白对IFN-β免疫应答的调节构成了正反馈循环，这可能也是宿主细胞在抑制病毒感染过程中自主增强I型IFN信号通路的一种重要机制。 ⑤社会经济效益，存在的问题：无社会经济效益。 ⑥历年获奖情况：无。 ⑦成果简介：IFITM是一种重要的宿主限制因子，它的表达受干扰素调控。关于IFITM的研究主要聚焦在它的抗病毒方面，该项目探究了IFITM对IFN-β信号通路的相关机制以及对EMCV病毒复制增殖的影响。结果表明IFITM蛋白能够抑制EMCV复制增殖，且IFITM蛋白能够增强IFN-β信号通路的表达。该研究表明IFITMs与I型IFN信号通路之间建立了正反馈循环，这对其抗病毒作用的发挥起到至关重要的作用，也为后续探明IFITMs的抗病毒作用机制奠定了基础。

1.课题来源与背景：该成果源自国家自然科学基金面上项目31972739。 2.研究目的与意义：以脂质代谢紊乱为主要特征的蛋鸡脂肪肝出血综合征，严重影响蛋鸡养殖业的经济效益；高脂血症在伴侣动物中的发病率亦呈逐年上升之趋势。前期研究表明，新型药用化合物阿司匹林丁香酚酯(AEE)，通过调控内源性代谢和肠道菌群的组成等，对高脂日粮诱导的实验动物高脂血症发挥确切的改善作用；但是，AEE降血脂的分子机理仍然不够明确。 该成果在实验动物体内的整体和分子水平，以及动物体内和体外的细胞水平，探讨并相互验证了AEE改善血脂的分子机制；为后续深入研究指明了方向，也为将AEE开发成兽医临床专用的改善脂质代谢紊乱的创新药物奠定了基础。 3.主要论点与论据：以高脂日粮诱导了实验动物的高脂血症模型，确认了AEE对不同实验动物高脂血症的防治作用。采用分子生物学方法考察了AEE对脂质代谢相关基因的转录、蛋白表达和酶活性的影响；系统生物学方法分析了AEE对模型大鼠肝脏胆汁酸(BAs)组成，对模型金黄地鼠内源性代谢物，以及ApoE-/-小鼠盲肠内容物的宏基因组，肝脏脂质组、转录组和蛋白组的调控作用；在脂质沉积的肝细胞模型上验证了AEE降脂作用的调控机理。结果显示，AEE可显著下调FXR而负反馈上调胆固醇代谢限速酶CYP7A1的表达与活性，促进胆固醇向BAs转化；下调OATPs、NTCP，抑制BAs肠肝循环过程中肝细胞对BAs的重新摄入，并将体内过多的BAs经粪便排出体外。多组学分析结果显示，AEE的降血脂作用，与其可使肝脏内G类结合型BAs上调，和T类结合型BAs下调相关；与其可改善肠道菌群，调控甘油磷脂代谢、胆汁酸代谢、脂质和动脉粥样硬化等通路相关。在脂质沉积的HepG2细胞模型上，验证了AEE可调节FXR-SHP-CYP7A1和FGF19-TFEB-CYP7A1通路中相关基因的表达，以显著上调CYP7A1的蛋白表达，而促进胆固醇代谢，最终达到改善模型细胞高脂状态的目的。 4.创见与创新：项目采用分子生物学和系统生物学方法，从不同层面探讨了AEE降血脂调控机理，明确了AEE促进胆固醇转化为胆汁酸并排出体外的调控机理，为后续研究指明了方向并奠定了基础。发表相关论文4篇，其中JCR Q1论文2篇；培养并毕业硕士和博士研究生各1名。 5.社会经济效益，存在的问题：以脂质代谢紊乱为主要特征的蛋鸡脂肪肝出血综合征，可严重降低产蛋率；而暂无特效药物。另外，随着社会生活节奏的加快，以及老龄化社会的到来，以犬、猫为代表的伴侣动物，已成为很多家庭的重要成员；高脂血症在在中老年伴侣动物中的发病率亦呈逐年升高之趋势。研发动物专用的相关药物，对于保障中国蛋鸡养殖业的健康发展，促进中国伴侣动物药物产业的发展等，具有重要意义。 AEE促进BAs代谢(促进生成、抑制肠肝循环、促进排泄)的调控网络、分子机制、作用靶点等尚不明确，待后续研究(32373071)深入探讨。AEE的临床研究较为滞后，正在开展后续的相关研究。 6.历年获奖情况：该成果的研究基础部分(国家自然科学基金青年基金31402252)，作为“AEE降血脂、预防血栓和抗氧化应激的调控机制”的组成部分，获得2021年度甘肃省自然科学三等奖。

①课题来源与背景：该课题为2021年立项的甘肃省重点研发计划项目《基于哺乳动物细胞基质的流感疫苗生产用无成瘤性MDCK细胞系的建立及应用》(项目编号：21YF1FA222)，经过两年的科学研究已完成全部研究计划并通过验收。 ②技术原理及性能指标：该项目将贴壁培养型MDCK细胞驯化成悬浮培养型，筛选生物学检测和成瘤性检测合格细胞进行生物反应器高密度大规模培养工艺和培养基优化研究。为流感疫苗生产建立全悬浮培养工艺提供细胞基质和技术支撑，促进疫苗行业向细胞基质转型和发展。 ③技术的创造性与先进性：随着现代生物技术的发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势，相较于传统鸡胚培养工艺有明显优势，全悬浮细胞培养技术工艺简单快捷，生产周期较短，大大降低成本，同时由于培养过程采用全自动化程序控制，整个培养过程容易控制，不易污染，易于放大；摆脱了对鸡胚依赖，没有处理鸡胚残体这一环节，既经济又环保。另外全悬浮培养可做到无血清或者低血清培养，动物成份大大降低，避免了鸡胚培养中由于含有大量杂蛋白而产生免疫副反应的问题，几乎没有出现不良反应；不存在鸡胚内源性病毒污染及母源抗体影响，可大大提高劳动生产效率，减少劳动强度等优势。相比之下全悬浮细胞培养技术用于流感疫苗的生产则更先进，更稳定，质量更可控。使用连续传代细胞系对生产生物制品是未来社会的发展方向，通过该项目的实施，为流感疫苗采用更加安全高效的生产方式提供了技术探索和贮备。 ④技术的成熟程度，适用范围和安全性：该项目建立的无血清悬浮培养型MDCK细胞接种于5L生物反应器，生长曲线近成“S”型，培养至72h时细胞密度为7.72±0.18×10⁶cells/mL、细胞活率为97.82%，接种流感病毒A/California/7/2009 X-179A(H1N1)，培养72h病毒滴度为6.26±0.20 lgTCID50/0.1mL。适用于H1N1流感病毒的培养。开发的MDCK细胞培养基可供悬浮细胞适用。 ⑤应用情况及存在的问题：该项目还处于研发阶段，研发需要大量的经费和人员投入，同时需要与疫苗生产企业对接完成疫苗生产下游工艺的研发和检测。

该项目由该公司所属的中哈兽用驱虫类药品国际科技合作基地与外方合作单位(哈萨克斯艾菲克有限公司等)研发机构密切合作，根据长期市场考察和基层临床资料的收集分析，针对寄生虫病防治中存在的用药量重复用药、疗效不确定等问题，利用哈萨克斯坦合作方的科研优势和经验，以及外方合作单位新研发成功的驱虫新药氯羟柳胺，结合该公司多年的品牌优势、研发、生产经验，通过对各类驱虫药疗效对比、药理分析、配伍比较、资料查询，选用高效抗寄生虫药物进行复合、科学配伍，运用国际现代最新药物制剂工艺，合作研发新型安全、高效的驱虫复方制剂。然后利用新产品的研发成果，建设一条符合GMP标准的片剂生产线，年产该产品1.2亿片，新增销售收入1500万元以上，创利税300万元。该产品预期在绿色规模养殖场和牧区示范推广，将惠及牛50万头、羊200万只、猪100万头、鸡50万只。 复方驱虫新制剂的联合研发及产业化项目，选用在国内国际比较领先的抗寄生虫药物进行复合，各成分在理化性质上不存在配伍禁忌，在药效上互补，驱虫谱辐射家畜常发寄生虫的多种门类，对常见的各类线、肝片吸虫、大片吸虫及寄生性昆虫(蜱、螨、虱、蚤、蝇等)均有驱杀作用。该品根据药物溶出、扩散、离子交换原理，制成骨架片，成为缓释长效制剂。概述来讲，创新点有以下几方面： (1)根据寄生虫临床防治经验，采用联合用药原理拟将伊维菌素与盐酸左旋咪唑、进口氯羟柳胺科学组方，制成复方驱虫片，三者优势互补，有效扩大驱虫谱，显著增强驱虫效果，一次服用，内外兼治，尤其适合潮湿环境下吸虫与其它寄生虫混合感染的情况，减少了多次投药和重复投药现象，并节省大量人工费用，适应牧区畜禽寄生虫病防治的实际需要。 (2)采用缓释制剂骨架片制作工艺，将该品制成复方缓释长效制剂，属胃内滞留剂，缓慢释放药物，药物充分吸收，药效维持长久，用药次数减少，是药物新技术新剂型在兽用复方驱虫药中的创新应用。 (3)配方设计科学，该品在剂量设定上以每35kg体重服用1片，在实际操作中简单易行，克服药物投服困难、劳动量大的问题。

“粮猪安天下”，中国猪肉生产和消费总量均列世界第一。生猪产业是繁荣经济、建设现代农业的重要组成部分。生猪疫病日益严重成为掣肘生猪产业健康发展的核心要素。副猪嗜血杆菌病是危害猪场最严重的细菌性疾病之一，主要危害5-8周龄断奶保育仔猪，发病率在30-60%，死亡率高达90%。其病原菌耐药谱广，地域特征明显，血清型复杂，导致原有疫苗所覆盖的血清型有限，交叉保护力低。课题组在省高校产学合作项目、省发改委战略新兴产业项目等支持下，历经14年，系统开展了副猪嗜血杆菌菌株分离鉴定及种毒筛选研究，创制了副猪嗜血杆菌多价疫苗，疫苗与田间流行菌株匹配度高，高效、安全、副反应小。有效解决了现有疫苗免疫交叉保护力弱、疫苗抗原含量低等突出问题。疫苗已在企业转化生产，全国推广应用。 主要创新点如下： 1.构建了全面系统的副猪嗜血杆菌细菌分离鉴定研究体系：率先建立了系统的副猪嗜血杆菌细菌分离鉴定体系，摸清了国内副猪嗜血杆菌病的流行本底，发现其耐药严重，耐药基因存在转移现象，探明了副猪嗜血杆菌的生物学特性及耐药机制。 2.成功创制多价灭活疫苗：选育出与国内副猪嗜血杆菌流行优势血清型匹配度高、安全性好，免疫原性强、性状稳定的血清1、4、5、12、13型疫苗菌株，收藏于中国微生物菌种保藏中心。创制了2种涵盖国内优势致病血清型的多价灭活疫苗，疫苗抗原与田间致病菌匹配度高，针对性强，均有良好交叉保护性，安全有效。其中所创制的4、5、12型三价灭活疫苗获国家三类新兽药证书和国家兽药产品生产批文，明确了副猪嗜血杆菌多价疫苗的免疫机制。 3.创新佐剂应用：首创将银杏叶黄酮苷作为副猪嗜血杆菌灭活疫苗佐剂，相比传统铝胶、矿物油佐剂，以4mg/mL银杏叶黄酮苷制备的佐剂疫苗能显著诱导仔猪机体产生细胞免疫，仔猪血清中的IL-2及IFN-γ等细胞因子水平都显著提高，IgG抗体水平也显著提升。银杏叶黄酮苷作为疫苗佐剂克服了传统油乳剂疫苗抗体易应激、易产生炎症等弊端。 4.优化生产工艺：优化副猪嗜血杆菌多价疫苗生产工艺，创新了一种细菌高效培养及菌苗超滤浓缩技术，突破传统菌苗产业技术瓶颈，副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗检验规程与质量标准列入农业农村部部兽医生物制品质量标准。 项目成果获得国家三类新兽药证书1件，国家兽药产品生产批文2件，列入农业部兽用生物制品质量标准1件，获得国家授权发明专利5件，国际授权专利1件，国家实用新型专利1件，发表论文18篇。项目创制的多价灭活疫苗在黑龙江、湖北、四川和福建等生猪主产区推广应用1060多万头生猪，出栏商品猪成活率平均提高了4.40%，创造经济效益2.92亿元。 项目成果经以中国工程院院士夏咸柱等专家组成的评审委员会评价，一致认为项目成果整体达到同类研究国内领先。其中，将银杏叶黄酮苷作为疫苗佐剂有创新性，达到国际先进水平。疫苗的推广使用，使生猪产业健康持续发展，提高了养殖户和养殖企业的收入水平。

(一)课题来源与背景：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是冠状病毒科冠状病毒属成员，引起的猪传染性胃肠炎是一种以呕吐、严重腹泻和脱水性肠炎为主要特征的高度接触性、致死性传染病，是严重危害国内外养猪业的重要疫病之一。模式识别受体是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，是机体启动天然免疫应答的重要组成元件，在先天性抗病毒免疫中发挥着尤为重要的作用。RIG-I是模式识别受体中极为重要的一类分子，其通过RLR级联信号诱导I型干扰素和炎症因子的产生，在抗病毒天然免疫中起着非常重要的作用，RIG-I已经被报道具有抑制多种RNA病毒复制的作用。据研究报道，冠状病毒具有多种策略拮抗宿主机体的天然免疫反应，抑制RLRs通路的激活，有些病毒能够通过修饰切割dsRNA从而使RLRs与其无法结合，有些是通过自身编码的蛋白对RLRs具有抑制作用，而TGEV作为冠状病毒科的重要成员与RIG-I之间有没有拮抗作用以及具有怎样的拮抗机制？还没有研究报道，所以该研究旨在探究猪传染性胃肠炎病毒拮抗RIG-I抗病毒作用。 基于此，向省科技厅申请实施甘肃省青年科技基金计划项目《猪传染性胃肠炎病毒拮抗RIG-I抗病毒作用》，并于2021年获得立项，项目编号为：21JR7RA719，项目资金4.00万元。 (二)研究目的与意义：天然免疫在机体抵抗外来病原微生物过程中发挥了重要作用，模式识别受体是机体发挥天然免疫的重要组成元件，在机体发挥天然免疫反应方面已发现了多种模式识别受体，如识别内体核酸的TOll样受体、识别病毒RNA的RIG-I样受体以及作为广谱DNA感受器的cGAS。RIG-I是RIRs家族的重要成员，至今已发现RIRs家族有RIG-I、MDA5和LGP2三个成员，RIG-I能够识别病毒双链RNA并通过RLR级联信号诱导I型干扰素和炎症因子的产生，在抗病毒天然免疫中起着非常重要的作用，RIG-I已经被报道在多种RNA病毒复制过程中发挥着重要的作用。该研究通过构建猪源RIG-I的真核表达质粒和针对猪源RIG-I合成干扰RNA，运用qRT-PCR方法和TCID50试验探究在RIG-I不同表达量的情况下对TGEV复制的影响；通过TGEV感染宿主细胞，运用qRT-PCR方法和Westorn-bolt试验探究随着TGEV的增殖对RIG-I蛋白表达的影响。该研究旨在探明TGEV拮抗RIG-I抗病毒作用以及为拮抗机制研究奠定基础。 (三)主要论点与论据： 1、该研究成功构建了猪RIG-I基因的真核表达粒p-RIG-I-His，并发现在PK-15细胞内能够成功表达且主要分布于细胞质中。论据：(1)从PK-15细胞中成功克隆了猪RIG-I基因，并将其插入真核表达粒构建出了猪RIG-I基因的真核表达粒p-RIG-I-His；(2)将真核表达粒p-RIG-I-His转染至PK-15细胞，进行western blotting和间接免疫荧光表达验证实验，结果显示，RIG-I在PK-15细胞内成功表达，大小约为110kDa，主要分布于细胞质中。 2、上调或下调表达RIG-I增加TGEV的复制。论据：(1)将构建的真核表达粒p-RIG-I-His转染至PK-15细胞进行过表达RIG-I对TGEV复制的影响试验，发现过表达RIG-I抑制TGEV的mRNA转录水平和病毒滴度；(2)设计合成了3对RIG-I的siRNA序列：sscRIG-I-234、sscRIG-I-1121、和sscRIG-I-2319，均能高效沉默RIG-I的表达，以其中的沉默效果最好sscRIG-I-1121进行下调表达RIG-I对TGEV复制的影响试验，发现下调表达RIG-I能够增加TGEV的复制。 3、TGEV感染可以上调RIG-I mRNA的转录水平和促进RIG-I蛋白表达，而随着TGEV感染时间的增加，TGEV可以降解RIG-I蛋白。论据：(1)通过qPCR和western blotting试验研究TGEV感染PK-15细胞后对RIG-I表达的影响，发现TGEV感染可以上调RIG-I mRNA的转录水平和促进RIG-I蛋白表达；(2)通过western blotting试验检测不同感染时间TGEV对RIG-I蛋白表达的影响，发现随着TGEV感染时间的增加RIG-I蛋白的表达量逐步降低。 (四)创见与创新： 1、TGEV与RIG-I存在拮抗关系，上调或下调RIG-I可以抑制或促进TGEV复制，TGEV感染可以促进RIG-I蛋白表达。 2、TGEV存在RIG-I蛋白降解机制，可以降解RIG-I蛋白。 (五)社会经济效益，存在的问题： 1.社会经济效益：该项目取得的社会效益：通过该项目的实施提升了青年科研人员的项目组织实施能力和科研创新能力；为TGEV拮抗RIG-I抗病毒作用的分子机制以及为探明在TGEV感染过程中RIG-I介导的抗病毒信号通路研究奠定了基础。该项目进行的是基础理论研究，不直接产生经济效益。 2.存在问题：该项目虽然在TGEV拮抗RIG-I抗病毒作用研究方面取得了不错的科研成果，但还需在“TGEV感染过程中RIG-I介导的抗病毒信号通路”方面进行深入研究，以期解析出TGEV拮抗RIG-I抗病毒作用的分子机制，为新型抗病毒药物开发奠定理论基础。